1、-防御素-3在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎大鼠肺组织中的表达 作者单位：430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉 430022武庆平 桂平 姚尚龙【摘要】 目的 研究大鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）呼吸机相关性肺炎（VAP）时肺组织中-防御素-3（BD-3）的表达，以探讨其在VAP发病机制中的作用。方法 20只清洁级雄性SD大鼠随机分为2组（n=10），非通气肺炎组（N组）和呼吸机相关性肺炎组（V组）。N组大鼠经口气管插管后立即接种2109菌落形成单位（cfu）的MRSA，V组大鼠经口气管插管并进行4h保护性
2、机械通气后气管内接种相同数量的细菌。接种后48 h处死大鼠，测定肺湿重与体重比（WW/BW），记录肺肉眼和病理学评分，并进行肺组织细菌计数和脾培养，免疫组化检测肺组织BD-3的表达。结果 与N组比较，V组WW/BW，肺病理学积分，肺组织细菌含量和菌血症发生率均显著升高（P均0.01），而BD-3的表达显著降低（P0.01）。结论 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎（MRSA VAP）显著重于非通气肺炎，这可能与机械通气降低了BD-3的表达有关。【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；呼吸机相关性肺炎；防御素Expression of beta-defensin-3 in lungs of r
3、ats with methicillin-resisitant Staphylococcus aureus ventilator-associated pneumonia GUI Ping Department of Anesthesiology , Union Hospital , Tongji Medical College , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022 , China Abstract Objective To study the expression of beta-defensin-3(B
4、D-3) in lungs of rats with methicillin-resisitant Staphylococcus aureus(MRSA) ventilator-associated pneumonia(VAP) and to investigate the role of BD-3 in the pathogenesis of VAP. Twenty specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats weighing 242286g were randomly divided into 2 groups: nonventilate
5、d pneumonia group(group N, n=10) and ventilator-associated pneumonia group(group V, n=10). Rats in group N were infected intrabronchially with 2109 colony-forming units(cfu) MRSA immediately after oral intubation while rats in group V were infected intrabronchially with the same amount of MRSA after
6、 oral intubation and 4 hours, protective mechanical ventilation. Rats from both groups were killed 48 h after inoculation. Lung wet weight to body weight ratios(WW/BW) were measured, lung macroscopic and microscopic scores were recorded, lung bacterial counts and spleen culture were also done. Expre
7、ssion of BD-3 in lung of rats was detected by immunohistochemistry staining. Results WW/BW, lung microscopic score, bacterial pulmonary concentration and the incidence of bacteremia in group V were significantly higher than in group N(P0.01), while expression of BD-3 was significantly lower than in
8、group N(P0.01). Conclusion Ventilator-associated pneumonia is more severe than nonventilated pneumonia，this may be related to the reduced expression of BD-3 by mechanical ventilation.Key words methicillin-resisitant Staphylococcus aureus; pneumonia, ventilator-associated; defensin呼吸机相关性肺炎（VAP）是重症监护室
9、最重要的感染并发症，接受机械通气的病人8%-28%会并发VAP，其死亡率高达24%-50%1。VAP治疗失败率如此之高的原因之一就是多重耐药病原体的感染，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是VAP常见的多重耐药病原体2。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌呼吸机相关性肺炎（MRSA VAP）已成为重症监护室里的一大挑战。-防御素-3（BD-3）是防御素家族中的一个成员，是上皮细胞分泌的一种重要的固有免疫效应分子，具有广谱高效的抗微生物活性，包括多重耐药的金黄色葡萄球菌，BD-3还能趋化单核细胞3。本实验拟建立MRSA VAP的大鼠模型，观察BD-3表达的变化，探讨BD-3在MRSA VAP发病机制中的作
10、用。材料与方法MRSA临床分离株（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科）；蛋白胨、酵母粉、琼脂粉（Oxoid公司，英国）；小鼠抗人BD-3单克隆抗体（immundiagnostik公司，德国）；SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；683型小动物容量控制呼吸机（Harvard Apparatus公司，美国）；HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）。MRSA临床分离株接种于液体LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠），于37C 220rpm的恒温摇床振荡培养79 h，取菌液0.1ml，用液体LB培养基进行10倍系列稀释，各取0
11、.1 ml接种于固体LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠、2%琼脂粉），于37C的细菌培养箱培养24 h后计算菌液的浓度，用生理盐水稀释成1010 cfu/ml备用。清洁级雄性SD大鼠20只，体重242286 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，随机分为2组（n10）：非通气肺炎组（N组）和呼吸机相关性肺炎组（V组）。腹腔注射20%乌拉坦1.3 g/kg麻醉后，N组大鼠直视下应用额镜经口气管插管（16G211的静脉套管针代替气管导管），确认导管在气管内后，经气管导管注入0.2 ml 1010cfu/ml的菌液，拔出气管导管；V组大鼠直视下应用额镜经口气管插管，确认导管位
12、置正确后，连接到683型小动物容量控制呼吸机进行保护性机械通气，通气参数设置如下：潮气量6 ml/kg，呼吸频率88次/min，呼气末正压5 cmH2O，吸入氧浓度21%，大鼠口腔填塞纱布条以防止漏气，通气4 h后经气管导管注入0.2 ml 1010cfu/ml的菌液，拔出气管导管。2组大鼠均于接种后48 h处死。处死大鼠前称体重（BW），开胸完整分离出肺并称重（WW），计算肺湿重与体重比（WW/BW）。记录肺肉眼评分，每一叶的评分按以下标准进行：正常（0），瘢痕（1），轻度充血（2），红色充血（3），灰色充血（4）和浅黄色充血（5）4。从每一叶肺（左肺、右肺前叶、右肺中叶、右肺后叶和右肺副叶
13、）固定位置各取1 cm左右大小的组织块，用于组织病理学和免疫组织化学检测，肺组织浸于4的多聚甲醛固定，于一系列浓度梯度的乙醇中脱水，石蜡包埋、切片，一部分切片HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变，组织病理学评分按以下标准进行：正常（0），脓性粘液栓（1），支气管炎（2），支气管肺炎（3），融合性支气管肺炎（4）和肺脓肿（5）5。另一部分切片用于免疫组化法检测肺组织BD-3表达， DAB染色，阳性染色为胞浆染成棕黄或棕褐色。阴性对照采用PBS代替一抗。每张切片随机选取5个视野（200），图象采用HMIAS-2000型全自动彩色图像分析系统进行蛋白半定量分析，以光密度反映BD-3蛋白含量。余下的肺
14、组织称重后加1 ml生理盐水匀浆，取匀浆液0.1 ml 10倍系列稀释后培养计数，肺组织细菌浓度以log10 cfu/g肺组织表示。分离出脾脏后，无菌生理盐水冲洗，匀浆后涂抹接种于LB琼脂平板，如有菌落生长，挑取菌落革兰染色，排除假阳性，真阳性表明发生了菌血症。采用SPSS10.0统计软件分析数据，计量资料以均数标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，菌血症发生率的比较采用u检验，P0.05为差异有统计学意义。结果2组大鼠发生的都是双侧不对称多病灶性肺炎，病变多以右肺后叶最为严重，见图 1。V组肺炎较N组重，无论是组织病理学方面还是细菌学方面。与N组比较，WW/BM和病理学评分显著升高（P
15、均0.05），见表 1，肺细菌浓度和菌血症发生率也显著升高（P均0.01），见表2。图 1 2组右肺后叶病理学结果（HE染色，200）表 1 2组WW/BM，肉眼评分和病理学评分的比较（n=10，）组别WW/BW（102）肉眼评分病理学评分N组0.990.1112.11.511.71.2V组1.210.10*12.61.313.41.2*与N组比较，* P0.01表 2 2组肺细菌浓度和菌血症发生率的比较（n=10，）组别肺细菌浓度（log10cfu/g）菌血症发生率N组8.70.420%(2/10)V组12.20.9*90%(9/10)*与N组比较，* P0.01BD-3主要表达于支气管上皮细胞和肺上皮细胞，见图2。N组和V组的平均光密度值分别是1.160.10和0.770.11，与N组比较，V组的BD-3表达显著降低（P0.01）。图 2 2组右肺中叶BD-3的表达（DAB显色，200）讨论VAP是重症监护室最重要的感染并发症，MRSA VAP成为一重大挑战。VAP的病理学特点是双侧不对称多局灶性肺炎，尤以下肺最为严重，不同阶段的病变共存6。VAP是感染和呼吸机相关性肺损伤共同作用的结果。预实验发现经气管接种108或109 cfu的MRSA引起的肺炎病变较轻，而经气管接种2109 cfu的MRSA引起的肺炎病理学改变符合VAP病理学特点，所以本实验采用经