1、第三章第三章 抗体制药抗体制药（二）（二）3 3学时学时 第三章 抗体制药 2 三、多功能抗体及其制备三、多功能抗体及其制备 近年来，在近年来，在scFv（单链抗体）的基础上，（单链抗体）的基础上，可以把两个或两个以上的可以把两个或两个以上的scFv重组在一起，重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。（简称多价微抗）。包括双链抗体（包括双链抗体（diabody），三链抗体），三链抗体（triabody），微型抗体（），微型抗体（minibody）及四）及四链抗体（链抗体（tetrabody）。）。第三章 抗体制药 3 多功能抗体及其
2、制备多功能抗体及其制备 双链抗体制备方法双链抗体制备方法：化学交联法、粘性蛋白结：化学交联法、粘性蛋白结构域融合法和接头长度控制法。构域融合法和接头长度控制法。微型抗体微型抗体：通过基因工程手段采用不同的接头：通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体（把单链抗体（VLVL-VH)VH)的的VHVH结构域与结构域与IGIG的的CHCH3 3结构域结构域融合，形成融合，形成VLVL-VHVH-CHCH3 3的结构。此种抗体合成后通的结构。此种抗体合成后通过过CH3CH3结构域形成稳定的二聚体形式，发挥其双价结构域形成稳定的二聚体形式，发挥其双价微抗的作用。微抗的作用。三链抗体三链抗体：在制备单链抗
3、体时，当接头的长度：在制备单链抗体时，当接头的长度为为2 2个或个或2 2个以下氨基酸残基时，或者直接把个以下氨基酸残基时，或者直接把VHVH结结构域构域N N末端与末端与VLVL结构域结构域C C末端相连，通过非共价键末端相连，通过非共价键而形成三聚体，称三链抗体。而形成三聚体，称三链抗体。第三章 抗体制药 4 第三章 抗体制药 5 抗体融合蛋白抗体融合蛋白 抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。新的特性，称之为抗体融合蛋白。根据构建方式的不同，抗体融合蛋白主要分为两种形式：根据构建方式的不同，抗体融
4、合蛋白主要分为两种形式：第三章 抗体制药 6 构建抗体融合蛋白的原则构建抗体融合蛋白的原则 将第一个蛋白的终止密码子删除，再将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。因，即可实现两个基因的共表达。抗体酶，酶抗体酶，酶-抗体型融合蛋白，在药物抗体型融合蛋白，在药物治疗中有广阔的前景，它可在靶向位治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，置上将前体药物转化成有效的药物，从而避免了对正常组织的损害。从而避免了对正常组织的损害。第三章 抗体制药 7 四、基因工程抗体和抗体工程四、基因工程抗体和抗体
5、工程 抗体研究的三大阶段：抗体研究的三大阶段：18901890年白喉抗毒素年白喉抗毒素多克隆抗体多克隆抗体；19751975年杂交瘤技术年杂交瘤技术单克隆抗体单克隆抗体；19941994年开始年开始基因工程抗体基因工程抗体 基因工程抗体基因工程抗体：不用人工免疫动物和细胞不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体。规模生产抗体。第三章 抗体制药 8 第三章 抗体制药 9 噬菌体抗体库技术的
6、基本方法噬菌体抗体库技术的基本方法 获取目的基因获取目的基因 抗体库技术的载体抗体库技术的载体 淘筛淘筛 表达与鉴定表达与鉴定 第三章 抗体制药 10 获取目的基因和载体获取目的基因和载体 获取目的基因获取目的基因：提取：提取mRNA mRNA 经反转经反转录录PCRPCR获取抗体某一特定基因区段，获取抗体某一特定基因区段，抗体基因的组合形式多为单链抗体。抗体基因的组合形式多为单链抗体。抗体库技术的载体抗体库技术的载体：噬菌体载体具：噬菌体载体具有噬菌体和质粒的共同特点。有噬菌体和质粒的共同特点。第三章 抗体制药 11 淘筛、表达与鉴定淘筛、表达与鉴定 淘筛：淘筛：抗原固相化后，对噬菌粒群的抗
7、原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，反复使目的克隆大量扩增。库，反复使目的克隆大量扩增。表达与鉴定表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌，进行可溶性表达。再导入感受态菌，进行可溶性表达。第三章 抗体制药 12 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 第三章 抗体制药 13 噬菌体抗体库的分类噬菌体抗体库的分类 第三章 抗体制药 14 噬菌体展示技术噬菌体展示技术 第三章 抗体制药 15 第三章 抗体制药 16 噬菌体抗体库技术的特点噬菌体抗体库技术的特
8、点 模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体。可获得高亲和力的人源化抗体。第三章 抗体制药 17 噬菌体展示技术最关键的优势噬菌体展示技术最关键的优势 第三章 抗体制药 18 噬菌体抗体库技术的优势噬菌体抗体库技术的优势 第三章 抗体制药 19 单克隆抗体杂交瘤技术和噬菌体抗体展示技术比较单克隆抗体杂交瘤技术和噬菌体抗体展示技术比较 第三章 抗体制药 20 基因工程抗体的表达基因工程抗体的表达 原核生物：大肠杆菌，分原核生物：大肠杆菌，分 融合表达和分泌融合表达和分泌表达；表达；真核生物：都是分泌表达，有酵母、昆虫真
9、核生物：都是分泌表达，有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。转基因植物：转基因植物：烟草烟草 转基因动物：单基因水平。转基因动物：单基因水平。第三章 抗体制药 21 抗体在体外人源化存在的问题抗体在体外人源化存在的问题 操作过程复杂操作过程复杂 成本高成本高 抗体的亲和力降低抗体的亲和力降低 抗体不是人体免疫系统自然产生抗体不是人体免疫系统自然产生 异源抗体与免疫系统的配合异源抗体与免疫系统的配合 第三章 抗体制药 22 最理想的单克隆抗体：最理想的单克隆抗体：100100人源化，由人体免疫系统自然产生人源化，由人体免疫系统自然产生。全人抗体的理论基础：全人抗体的
10、理论基础：癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物；癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物；人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有清除能力；清除能力；免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应；做出反应；体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体。体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体。全人抗体面临的关键问题：全人抗体面临的关键问题：持续分泌抗持续分泌抗体的人体的人B B细胞、抗体分泌细胞的保持。细胞、抗体分泌细胞的保持。第三章 抗体制药 23 第三章 抗体制药 24 第三章 抗体制药 25 第三章 抗体制药 26 第三章 抗体
11、制药 27 第三章 抗体制药 28 第三章 抗体制药 29 第三章 抗体制药 30 第三章 抗体制药 31 五、抗体诊断试剂五、抗体诊断试剂 抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。可呈现某种反应。在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型测定。型测定。第三章 抗体制药 32 抗体诊断药物分类抗体诊断药
12、物分类 三类：三类：血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂 免疫标记技术用的抗体类试剂免疫标记技术用的抗体类试剂 导向诊断药物导向诊断药物 第三章 抗体制药 33 血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定血清学鉴定 是指用已知抗体来鉴定未知的抗原是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反应。和血型鉴定。常用凝集反应。第三章 抗体制药 34 鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂 用单克隆抗体可以检测出多种病毒中用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异；非常细微的株间差异；鉴定细菌的种
13、型和亚种，这是传统血鉴定细菌的种型和亚种，这是传统血清法或动物免疫幅所做不到的，而且清法或动物免疫幅所做不到的，而且诊断异常准确。诊断异常准确。还可以检查出某些还尚无临床表现的还可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的位置极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的位置和面积，为有效治疗提供方便。和面积，为有效治疗提供方便。第三章 抗体制药 35 常用品种和用途常用品种和用途 诊断血清诊断血清 分群血清分群血清 分型血清分型血清 因子血清因子血清 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清 第三章 抗体制药
14、 36 诊断血清的制备步骤诊断血清的制备步骤 制备细菌抗原制备细菌抗原：细菌接种、培养、收集菌：细菌接种、培养、收集菌苔、制成菌液；苔、制成菌液；免疫动物和制备抗体血清免疫动物和制备抗体血清：动物有家兔、：动物有家兔、马、羊、豚鼠；马、羊、豚鼠；免疫途径免疫途径：静脉、腹腔、：静脉、腹腔、皮下。接种次数皮下。接种次数37次，每次间隔次，每次间隔34天，天，末次注射后末次注射后68天取血样测效价，达到要天取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。求，即可采血，离心分离血清。诊断血清的诊断方法：直接凝集反应诊断血清的诊断方法：直接凝集反应 第三章 抗体制药 37 第三章 抗体制药 38 乙型
15、肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂 第三章 抗体制药 39 妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂 妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCGHCG（human human chorionic gonadotrophinchorionic gonadotrophin，人绒毛膜促性，人绒毛膜促性腺激素）含量增高，在腺激素）含量增高，在3 3个月内达到高峰。个月内达到高峰。此时检测尿液中的此时检测尿液中的HCGHCG，就可确定是否怀孕。，就可确定是否怀孕。第三章 抗体制药 40 抗ABO血型系统血清 按照人红细胞带有的按照人红细胞带有的A A或或B
16、B种凝集原，可将血型分种凝集原，可将血型分为为A A、B B、ABAB和和O O型型4 4种。种。ABOABO血型抗血清的制备：血型抗血清的制备：1 1、人源性、人源性ABO ABO 血型抗血清是采集健康献血人的血液，血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置凝固后，置4 4 度过夜，使冷抗体吸附在血块上一度过夜，使冷抗体吸附在血块上一起除掉。起除掉。2 2、动物源性、动物源性ABO ABO 血型抗血清是用人血型物质血型抗血清是用人血型物质A A 和和B B 免疫马得到的。免疫马得到的。3 3、单克隆抗体是应用、单克隆抗体是应用B B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A A 或抗或抗B B血清。血清。血型鉴定的方法：玻片直接凝集法。血型鉴定的方法：玻片直接凝集法。第三章 抗体制药 41 第三章 抗体制药 42 免疫标记技术用的抗体类试剂免疫标记技术用的抗体类试剂 给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗体进行定性的反应得以显现，可对微量抗