1、胚胚 胎胎 干干 细细 胞胞 王王 锋锋 王王 子子 玉玉 逸夫楼逸夫楼3084 84395381 南京农业大学动物胚胎工程技术中心南京农业大学动物胚胎工程技术中心 动物胚胎工程之动物胚胎工程之 内内 容容 个体发生过程个体发生过程 干细胞的概念干细胞的概念 胚胎干细胞概念胚胎干细胞概念 应用前景应用前景 面临的问题及解决办法面临的问题及解决办法 一一、个体发生过程、个体发生过程 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天 精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构 囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道消化道
2、、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统 囊囊 胚胚 ICM 二、干细胞的概念二、干细胞的概念 1、干细胞：、干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞。化成各种功能细胞。2、分类、分类 （1）全能干细胞，包括：）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）生殖干细胞（细胞）生殖干细胞（embryonic germ
3、 cells,EG细胞）细胞）具有全能性，能够分化成所有细胞类型，具有全能性，能够分化成所有细胞类型，进一步形成机进一步形成机体的任何组织和器官。体的任何组织和器官。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。细胞分化。干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分化的细胞型的细胞。化的细胞型的细胞。动物体内干细胞的正常作
4、用是在发育的过程中可提供不同动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供不同的细胞型的细胞型,以生长成不同的组织和器官。它们也提供替代以生长成不同的组织和器官。它们也提供替代细胞以修复身体不同部分的损伤。细胞以修复身体不同部分的损伤。干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞,通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退行性过程和损伤中失去的细胞。行性过程和损伤中失去的细胞。使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿瘤形成的风险。瘤形成的风险。目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下目前人干细胞的主要来源或
5、者潜在来源如下:胚泡胚泡,可以提供多能干细胞可以提供多能干细胞;胎儿组织胎儿组织,可以提供多能或者专能干细胞可以提供多能或者专能干细胞;脐带血脐带血,可以提供专能干细胞可以提供专能干细胞;成人组织成人组织,可提供专能干细胞或单能干细胞。可提供专能干细胞或单能干细胞。三、胚胎干细胞三、胚胎干细胞 1 1、概念、概念 胚胎干细胞胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)(embryonic stem cells,ESC)是一种从是一种从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。养、克隆等得到的
6、具有发育全能性的细胞。ESES细胞可不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍细胞可不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍能具有发育成三个胚层的潜能。能具有发育成三个胚层的潜能。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。些特性。ESES细胞的全能性（细胞的全能性（totipotentytotipotenty），是指），是指ESES细胞在细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即各种组织的发育潜
7、力，即ESES细胞发育成完整动物细胞发育成完整动物体的能力体的能力。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。ESES细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。验材料。ESES细胞全能性的检测方法是以细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胚胎干细胞进行细胞核移植胞核移植。如果。如果ESES细胞能和去核的细胞融合发育细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植
8、，重构胚能发育形成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成个体，则表明成个体，则表明ESES细胞具有全能性。细胞具有全能性。例如，将绵羊的类例如，将绵羊的类ESES细胞注射到去核卵母细胞中，细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类产生，证明了绵羊的类ESES细胞具有发育全能性。细胞具有发育全能性。2 2、ESES细胞研究发展史细胞研究发展史 19811981年，英国剑桥大学的年，英国剑桥大学的EvansEvans和和KaufmanKaufman用囊用囊胚内细胞团胚内细胞团(ICM)(ICM)建立小鼠建立
9、小鼠ESES细胞系细胞系 19981998年美国年美国ThomsonThomson从人的体外受精囊胚中分离从人的体外受精囊胚中分离得到了得到了ESES细胞。同年约翰霍普金斯大学的细胞。同年约翰霍普金斯大学的ShamblottShamblott等从人的等从人的PGCPGC细胞中分离得到人的全细胞中分离得到人的全能性干细胞。能性干细胞。人人ESES细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移植打下了基础。移植打下了基础。其他动物只获得了类其他动物只获得了类ESES细胞。细胞。19991999年年1212月，美国月，美国科学科学杂志公布了当年世界科学进展杂志公布了当年世
10、界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。20022002年年3 3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导目前已有报导ESES细胞能在适当条件下分化为细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮
11、细胞，肝细胞等。岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。1.1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.2.永生化永生化(immortal)(immortal)；3.3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.5.能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程；3 3、胚胎干细胞的性质、胚胎干细胞的性质 4 4、胚胎干细胞系的建立过程、胚胎干细胞系的建立过程 分离囊胚的内细胞群分离囊胚的内细胞群 与成纤维细胞共培养，与成纤维细胞
12、共培养，ES 细胞非分化增殖细胞非分化增殖 分离胚胎生殖腺脊细胞分离胚胎生殖腺脊细胞 -胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定-定向诱导分化定向诱导分化-成体干细胞成体干细胞-功功能细胞能细胞 4.1 概述概述 4.2 胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离 酶消化后培养酶消化后培养 免疫方法去处滋养层细胞免疫方法去处滋养层细胞 流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法 4.3 培养条件：培养条件：(1)特殊的培养液：用特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，加非必须氨基酸；血清的浓度和质量很重要，加非必须氨基酸；-巯基乙醇。巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为以人或胚
13、鼠的成纤维细胞为饲养层细胞饲养层细胞。(3)必须加入必须加入LIF，抑制细胞分化。，抑制细胞分化。早期胚胎及早期胚胎及PGCsPGCs的培养的培养 将早期胚胎或将早期胚胎或PGCsPGCs置于饲养层或条件培养基上，置于饲养层或条件培养基上，在在5%CO5%CO2 2、37373939度条件下进行培养。度条件下进行培养。培养液一般为培养液一般为DMEEM+15%FCSDMEEM+15%FCS。培养液中可添加多。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如种细胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF.3LIF.EGF.IGF.3-巯巯基乙醇等。基乙醇等。传传 代代 进行体外培养时，当进行体外培养
14、时，当ICMICM增殖后或增殖后或PGCsPGCs出现出现ESES样克隆样克隆后即可传代。后即可传代。ESCESC的增殖速度很快，小鼠的增殖速度很快，小鼠ESCESC每每7 78h8h倍增一次倍增一次;猪类猪类ESCESC每每20h20h倍增一次倍增一次;羊类羊类ESCESC，每，每404050h50h倍增一次倍增一次;牛类牛类ESCESC每每181824h24h倍增一次。倍增一次。传代时一般是用胰酶传代时一般是用胰酶EDTAEDTA消化，再用微吸管或拨针将消化，再用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后，即可出现新的克隆
15、点，在其分化之前可以再进天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。行传代。5.5.胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞的鉴别 （1 1）细胞形态与结构）细胞形态与结构 ESES细胞形态表现为胞体小、泡状、核大细胞形态表现为胞体小、泡状、核大 (核核质比高质比高)、细胞聚集成集落生长、细胞聚集成集落生长（鸟巢状）、（鸟巢状）、细细胞排列紧密、无细胞界限、能连续稳定传代且不胞排列紧密、无细胞界限、能连续稳定传代且不分化。分化。（2 2）细胞功能）细胞功能 （3 3）细胞表面的特殊标志：）细胞表面的特殊标志：AKPAKP阳性阳性 （4 4）细胞内特异基因的表达）细胞内特异基因的表达 胚胎干细胞检测
16、指标胚胎干细胞检测指标 (1)(1)细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高 (2)(2)端粒酶活性高端粒酶活性高 (3)(3)不被不被Hoechst33342 Hoechst33342 和和Rhodamine123Rhodamine123染色染色 (4)(4)细胞膜表面有特殊的标记：细胞膜表面有特殊的标记：SSEASSEA-3,SSEA3,SSEA-4,4,TRATRA-1 1-60,TRA60,TRA-1 1-8181。(5)(5)能分化成三个胚层的细胞，将能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植胚胎干细胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤 (6)(6)可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞 ICM细胞细胞 EG细胞细胞 来源来源 附置前早期胚胎附置前早期胚胎内细胞团内细胞团 早期胎儿生殖嵴早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞原始生殖细胞 形态学形态学 直径一般为直径一般为1215m 直径一般直径一般1518m 胰岛素样生长因胰岛素样生长因子受体子受体(Insulin-likereceptor,Igf2r)基因甲基化状态基因甲基化状态 印记基因印