1、1 第一章、植物病原真菌的分离、第一章、植物病原真菌的分离、培养及纯化技术培养及纯化技术 2 1 1）材料：）材料：马铃薯马铃薯200g200g、葡萄糖、葡萄糖20g20g、琼脂、琼脂20g20g、水、水1000ml1000ml 1、马铃薯葡萄糖琼脂（、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基）培养基 马铃薯葡萄糖琼脂：马铃薯葡萄糖琼脂：potato dextrose agar,简称简称PDA；马铃薯蔗糖琼脂：马铃薯蔗糖琼脂：potato sucrose agar,简称简称PSA。一、一、真菌学研究中常见的真菌学研究中常见的培养基的制作和灭菌培养基的制作和灭菌 3 4 2 2）制作步骤）制作步骤 马铃
2、薯洗净，去皮称马铃薯洗净，去皮称200g200g切块切块/条，条，1000ml1000ml水煮沸水煮沸30min30min，用双层纱布滤去薯块，用双层纱布滤去薯块，加入加入1515-20g20g琼脂，加热熔化，再加琼脂，加热熔化，再加20g20g葡萄糖，葡萄糖，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤，待完全溶解后，趁热用双层纱布再过滤，补水并定容到补水并定容到1000ml,1000ml,分装于三角瓶或试管中，分装于三角瓶或试管中，塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。塞好棉塞并包上牛皮纸，扎紧后高压灭菌。5 自然自然pH；调调pH值值，也可用也可用1mol/L的的NaOH或或HCl调至调至pH为为
3、5.56.5之间，最后加水补足至之间，最后加水补足至1000mL。Tips:实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。免使用。6 2、植物组织和煎汁、植物组织和煎汁 许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。能做培养
4、基使用。植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，液，如加琼脂即能制成固体培养基。如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须当然，必须灭菌后灭菌后才能使用。才能使用。7 3、培养基的分装、培养基的分装 根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或三角瓶中。或三角瓶中。试管分装时，使用玻璃漏斗。试管分装时，使用玻璃漏斗。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的分装量为管高的1/5左右左右，
5、用三角瓶分装培养基时，用三角瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的容量不宜超过容积的1/3-1/2。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。湿棉塞而引起污染。8 制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。4、灭菌、灭菌 高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：15磅磅/英寸或英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续持续15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干晾干/烘干烘干、包装好，进行
6、干热灭菌。、包装好，进行干热灭菌。灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。化学灭菌、以及辐射灭菌等。9 滤膜孔径主要有滤膜孔径主要有0 0.2222 m m和和0 0.4545 m m两种两种。过过滤太快滤太快，滤液中将混入细菌而使除菌不完全滤液中将混入细菌而使除菌不完全。10 11 5 5、斜面、平板培养基的制作、斜面、平板培养基的制作 试管培养基试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度
7、的2/52/5至至3/53/5，冷凝后即成斜面培养基。冷凝后即成斜面培养基。三角瓶三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。培养基。方法是方法是：将培养基冷却至：将培养基冷却至45455050（低于（低于4545易凝固，应在易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小
8、缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约好伸入，倾入培养基约15mL15mL，平置、凝固即成。，平置、凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用注意：操作者事先必须洗净手，并用70%70%酒精消毒。酒精消毒。12 二、真菌分离二、真菌分离 植物病原菌的植物病原菌的分离培养，是植物分离培养，是植物病理实验室工作中病理实验室工作中的基本技能。的基本技能。13 真菌的分离真菌的分离-就是将所需要的真菌与其它杂菌就是将所需要的真菌与其它杂菌分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯分开，供给适当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。培养。一般是根据该微生物对一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气营养、酸碱度、氧气等条
9、件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。的环境，从而得到纯菌株。14 观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而观察一种真菌病害的标本，不一定都能检查到子实体而 作出作出诊断诊断。同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能同时，在病部表面或组织中检查到的真菌，有时也不能断定就是它的病原物，也有可能是植物组织死亡后在上面断定就是它的病原物，也有可能是植物组
10、织死亡后在上面生长的生长的腐生性腐生性真菌。真菌。因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培因此，对有些病害病原物的确定，最好是经过分离和培养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病养工作，且在适当的环境下进行接种试验，确定它的致病性。性。此外，为了此外，为了进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生进一步研究真菌的形态、生活史、生理和生态，态，或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯或者用于发酵如生产抗菌素等，分离而获得真菌的纯培养物是必要的。培养物是必要的。（一）目的意义（一）目的意义 15 分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下分离和培养应该在无菌至少很清洁的条件下进行进
11、行。（二）、真菌分离的程序（二）、真菌分离的程序 1 1分离前的准备工作分离前的准备工作 16 1.1 1.1 清洁环境：清洁环境：分离工作严格说应在无菌条件下进行，分离工作严格说应在无菌条件下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。为了保证无菌操作，应注意下面几点：为了保证无菌操作，应注意下面几点：1.2 1.2 若限于条件实验只能在若限于条件实验只能在普通房间普通房间进行时，必进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些地上多洒些水水，以消除室内尘埃，工作台上铺好，以消除室内尘埃，工作台上铺好
12、湿毛巾湿毛巾，点燃酒精灯。，点燃酒精灯。17 1.3 1.3 分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，分离工作开始前最好将所需的一切用品都准备好，放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过放在超净工作台内或伸手可及的台外，以避免操作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；程中频繁走动，破坏环境带来杂菌；1.4 1.4 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；1.5 1.5 无菌操作前还要用无菌操作前还要用7070酒精擦手；酒精擦手；1.6 1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不要说话等。要说话等
13、。18 分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。病害材料应尽可能新鲜病害材料应尽可能新鲜，如可选择，如可选择新近发病新近发病的植株、的植株、器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。器官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。最好在病、健交接处选材取样最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。跃，容易分离成功。2 2分离材料的选择分离材料的选择 19 例如：例如：果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂
14、的部分分离。果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较远的部分分离。远的部分分离。值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到病菌的。当然，这类病害是比较少的。病菌的。当然，这类病害是比较少的。从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部分病害都是适用的。分病害都是适用的。20 采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐
15、生菌，有时可采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以以采用接种后再分离的方法采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织，即将沾染有腐生菌的病组织作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等作为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用发病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得较多的是植物病原细菌的分离。得较多的是植物病原细菌的分离。引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属和疫霉属(Phytophthora)的真菌，用这种方法分离的效果也很好。的真菌，用这
16、种方法分离的效果也很好。分离烟草的根腐病菌分离烟草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用这种方法效果也很好，用这种方法效果也很好，将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草将烟草种子播在培养皿中的吸水纸上，然后用田间采得的烟草病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基病根切成小块，撒在种间，幼苗染病后移到胡萝卜琼脂培养基平板上，病菌即生长而得到纯培养。平板上，病菌即生长而得到纯培养。21 （1 1）酒精酒精 用用酒精（酒精（70%70%）消毒，只浸很短的时间（几秒钟消毒，只浸很短的时间（几秒钟到到1 1分钟），然后用灭菌水冲洗；分钟），然后用灭菌水冲洗；较大的材料较大的材料往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞往往是在酒精中浸过后，或用棉花塞蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧蘸酒精涂在组织表面，然后都在火焰上将酒精烧去。去。3 3组织的表面消毒剂组织的表面消毒剂 22 配方为：配方为：升汞升汞 1g1g，浓盐酸浓盐酸 2.5mL2.5mL，加水加水 至至 1000mL1000mL。将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后