1、安徽大学安徽大学细胞工程细胞工程精品课程精品课程 陈勤陈勤 第第12章章 花药培养和花粉培养花药培养和花粉培养 安徽大学安徽大学细胞工程细胞工程精品课程精品课程 陈勤陈勤 主要内容主要内容 花粉和花药培养技术花粉和花药培养技术 花粉和花药培养应用花粉和花药培养应用(1)掌握花药培养和花粉培养的区别掌握花药培养和花粉培养的区别(2)了解花药最佳接种时期了解花药最佳接种时期(3)掌握花药培养的大致过程掌握花药培养的大致过程(4)掌握花粉发育的四种途径掌握花粉发育的四种途径(5)掌握花粉培养的大致过程掌握花粉培养的大致过程 教学目的与要求教学目的与要求 胚珠胚珠 花的结构花的结构 花药花药是花的雄性
2、器官，花药培养属器官培养；是花的雄性器官，花药培养属器官培养；花粉花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似 花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株。体植株。单倍体植株单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种重要手段。重要手段。一、概一、概 述述 安徽大学安徽大学细胞工程细胞工程精品课程精品课程 陈勤陈勤 植物的花粉植物的花粉是花粉母细胞经减
3、数分裂形成的，其染色体数是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞单倍体细胞(haploid cell)。花粉和花药的培养花粉和花药的培养(pollen and anther culture)是指花粉在培是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。由单个花粉粒发育成完整植株的技术。用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫做做单倍体植物单倍体植物(haplobiont)。一、概
4、一、概 述述 花药培养花药培养 是将花粉发育至一定阶段的是将花粉发育至一定阶段的花药花药接种到人工培养基接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。植株的技术。花粉和花药培养的研究意义花粉和花药培养的研究意义 诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率有利于筛选隐性突变体，提高选择效率 获得无病毒个体获得无病毒个体 有利于隐性基因控制性状的选择有利于隐性基因控制性状的选择 快速获得自交系的超雄株快速获得自交系的超雄株 单倍体植株育种单倍体植株育种
5、 花药培养简史花药培养简史 1964年：印度学者年：印度学者古哈古哈(Guha)和和马斯瓦瑞马斯瓦瑞（Maheswari）将南洋金花花药培养发育成胚将南洋金花花药培养发育成胚 1967年：年：包金包金(Bourgin)和和尼奇尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植花药培养获得烟草植株株 1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株株 花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使
6、单倍体加倍，作为育种材料的来源。作为育种材料的来源。利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。构建永久性分离群体构建永久性分离群体双单倍体系双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位。，用于基因定位。双单倍体：双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自
7、发加倍后得是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。花药培养与单倍体育种花药培养与单倍体育种 大大缩短育种周期大大缩短育种周期 通过多次自交或近交获得的几乎是同质结合的品系通过多次自交或近交获得的几乎是同质结合的品系 单倍体植株再通过某种手段使染色体组加倍（如秋单倍体植株再通过某种手段使染色体组加倍（如秋水仙素处理）从而使植物恢复正常染色体数水仙素处理）从而使植物恢复正常染色体数 确定取材时间确定取材时间 选择大致处于所需要时期的选择大致处于所需要时期的花蕾花蕾。由于花粉发育时期和
8、植株。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。期。在在水稻水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为在外部形态上可根据叶枕距为515cm，颖片（禾本科植物，颖片（禾本科植物小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的长度的1/2这些条件来判断。这些条件来判
9、断。二、花药培养技术二、花药培养技术 水稻花药培养水稻花药培养 旗叶鞘用旗叶鞘用70酒精擦洗一遍酒精擦洗一遍 剥去旗叶鞘，取出稻穗剥去旗叶鞘，取出稻穗 左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中 70酒精，洗酒精，洗2遍遍 用接种环接种到培养基上用接种环接种到培养基上 培养培养5天后，花药变黑褐色，天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色天花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。选取主穗（一级侧枝）的选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好
10、，数量大，发蕾发育良好，数量大，发育同步。育同步。操作过程中不应使花药受操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。伤组织。注意事项注意事项 光照光照(1218h，5,00010,000 lx，28)黑暗黑暗(12-16h，22)周期交替进行。周期交替进行。花药培养的条件花药培养的条件 花粉发育时期是影响培养效果的重要因素花粉发育时期是影响培养效果的重要因素 在诱导花粉进行雄性发育在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株粉植株)过程
11、中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多数植物来说，数植物来说，单核中期或晚期的花粉单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。粉愈伤组织。如如南洋金花南洋金花、烟草烟草和和芍药芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时中的最适时期是第一次有丝分裂时期或稍前后，期或稍前后，禾本科植物禾本科植物在单核早期在单核早期(大麦大麦)或单核中期或单核中期(玉米、玉米、小麦小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。1、影响花药诱导频率的因素、影响花药诱导频率的因素 花药供体植株的生长条件对花药培养反应的
12、影响花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响很大很大 例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化同步化程度高程度高。培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件 我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出出N6培养基。在培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。高。N6培养基的特点培养基的特点是是铵离子浓度较
13、低铵离子浓度较低。随后，进一步降低随后，进一步降低铵盐铵盐和和硝酸盐硝酸盐浓度，同时附加浓度，同时附加生物素生物素，研，研制出制出C17和和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出愈率。愈率。以以马铃薯提取液马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地应用于小麦花药培养，效果良好。应用于小麦花药培养，效果良好。培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径 一般在禾本科植物中，常用一般在禾本科植物中，常用15mg/L 2,4-D或或NAA诱导花粉愈伤诱导花粉愈
14、伤组织形成，再将愈伤组织转移至组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分降低或去除生长素或补加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。诱导器官分化和再生植株形成。培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响 朱至清等朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21 mg/L葡葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加频率可增加210倍。倍。一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的
15、生长而对花粉的生一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生长无妨碍。长无妨碍。最适蔗糖浓度：最适蔗糖浓度：烟草的为烟草的为3 水稻为水稻为36 玉米则为玉米则为1215 在培养基中加入活性炭能促进花药培养在培养基中加入活性炭能促进花药培养 水稻的柱头水稻的柱头-花药花药 以以15预低温处理预低温处理小麦幼穗小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的，能提高花粉愈伤组织的产量。产量。例如，在例如，在4下冷冻下冷冻石刁柏花蕾石刁柏花蕾，预处理，预处理4天、天、8天和天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、倍、1.9和和1.5倍。倍。各种植物要求预处理
16、的温度和时间不同。各种植物要求预处理的温度和时间不同。2、低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率 小麦小麦要求先高温培养要求先高温培养64天之后，再转入天之后，再转入2830下培养。一下培养。一直高温培养效果并不好。直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化分化白化苗白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。个有效措施。培养温度是影响花药反应的一个重要因素培养温度是影响花药反应的一个重要因素 3、花药培养过程、花药培养过程 花药材料的选取花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药从减数分裂期至双核期的花药，均有可能，均有可能诱导离体孤雄发育。诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。或