1、 细胞生物学实验课件细胞生物学实验课件 实验三实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察植物细胞骨架的光学显微镜观察 一一.实验目的实验目的 1.掌握考马斯亮蓝掌握考马斯亮蓝R250 对植物细胞骨架染色的方法。对植物细胞骨架染色的方法。2.通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。态观察。二二.实验原理实验原理 细胞骨架细胞骨架(cytoskeleton)(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络 结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分
2、为结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微丝、微管和中等纤维微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运 输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂本试验采用去垢剂TritonXTritonX-100100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的 膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后 者用考马斯亮蓝者用考马斯亮蓝
3、R250R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。三三.实验用品实验用品 1.1.材料：洋葱材料：洋葱 2.2.器材：器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml50ml烧杯烧杯 药品药品：pH6.8pH6.8的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液；M-缓冲液缓冲液：50mmolL-1(PH 6.7)咪唑咪唑、50 mmolL-1 KCl、0.5 mmolL-1 MgC12 、1 mmolL-1 EGTA、0.1 mmolL-1 EDTA、1 mmolL-1巯基乙醇巯基乙醇、4 mmolL-1甘油甘油 、1
4、 mmolL-1 HCl 调调pH 至至7.2；1%Triton1%Triton-X100X100:用用M-缓冲液缓冲液配配 制；制；3%戊二醛戊二醛：用：用pH6.8pH6.8的磷酸缓冲配制；的磷酸缓冲配制；0.2%0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝 R250R250 染液染液：0.8g0.8g考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250R250、46.5ml46.5ml甲醇、甲醇、7ml7ml冰醋酸冰醋酸、46.5ml46.5ml蒸馏水。蒸馏水。四四.实验方法步骤实验方法步骤 1.1.撕取洋葱鳞茎内表皮撕取洋葱鳞茎内表皮1cm2若干片，置于小烧杯中。若干片，置于小烧杯中。2.2.用磷酸缓冲液（用磷酸缓冲液（pH
5、6.8）提前浸泡）提前浸泡2小时左右。小时左右。3.3.吸去磷酸缓冲液，用吸去磷酸缓冲液，用1%TritonX100处理处理20分钟。抽提细胞骨架以外的蛋白质，从而分钟。抽提细胞骨架以外的蛋白质，从而使骨架图像更加清晰。使骨架图像更加清晰。4.4.吸去吸去TritonXTritonX-100100，用，用M-缓冲液洗缓冲液洗2次，每次次，每次5分钟。分钟。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。缓冲液有稳定细胞骨架的作用。5.5.用用3%戊二醛固定戊二醛固定0.51h。6.6.用磷酸缓冲液（用磷酸缓冲液（pH6.8）洗）洗2 2次，每次次，每次5 5分钟。分钟。7.7.考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 染色染色30分钟。分钟。8.8.蒸馏水洗蒸馏水洗2次。次。9.9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。五五.实验报告实验报告 1.1.绘出洋葱鳞叶内表皮细胞内细胞质骨架的分布图。绘出洋葱鳞叶内表皮细胞内细胞质骨架的分布图。2.2.说明实验过程中各步骤处理的作用。说明实验过程中各步骤处理的作用。细胞骨架细胞骨架