1、第八讲 生殖发育毒性及其试验与评价方法 2 第一节 概 述 哺乳动物的生育繁殖过程哺乳动物的生育繁殖过程 外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育的影响 外源化学物对生殖发育损害作用的特点外源化学物对生殖发育损害作用的特点 3 哺乳动物的生育繁殖过程哺乳动物的生育繁殖过程 生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生（即精子发生和卵细胞发生）、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称繁殖过程。连续、完整的生殖发育过程的六个阶段连续、完整的生殖发育过程的
2、六个阶段 A.从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育与成熟、交配行为、受精。B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、肧体发育、主要器官形成。D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长、器官的发育与生长。E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的适应、达到完全的性功能。4 5 外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育的影响 干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。可以通过对内分泌系统，特别
3、是对性腺的作用，发生间接的影响。神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程。6 外源化学物对生殖发育损害作用的特点外源化学物对生殖发育损害作用的特点 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感；外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。不仅直接涉及雌雄两性个体，同时还对其第二代甚至以后世代的个体产生影响。7 第二节 生殖毒性及其评价 生殖毒性的表现生殖毒性的表现 生殖毒性的评价方法生殖毒性的评价方法 8 1950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形。1956年用于治疗妊娠反应的
4、反应停，1961年后出现近万例短肢畸形儿(海豹畸形)。二恶英(TCDD)造成的大面积污染及其与人群生殖危害的关系至今仍不清楚。过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生，在世界范围内提高了人们对用药的安全意识，高度关注新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响，促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方法指南的问世。9 一、生殖毒性表现一、生殖毒性表现 外源化学物对生殖的过程的损害作用可以外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减性无能或各种形式的性功能减退退。雌性可出现排卵规律改变雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失月经失调或失经经
5、，卵巢萎缩卵巢萎缩，受孕减少受孕减少，胚胎死亡胚胎死亡，生殖能生殖能力的降低不孕或不育等力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎雄性可表现为睾丸萎缩或坏死缩或坏死，精子数目减少精子数目减少。对雄性生殖系统的毒作用对雄性生殖系统的毒作用 直接损伤睾丸中的细胞群直接损伤睾丸中的细胞群 对精子发生的有害作用对精子发生的有害作用 继发性的影响精子发生继发性的影响精子发生 改变下丘脑改变下丘脑-垂体功能垂体功能 直接影响睾丸细胞功能直接影响睾丸细胞功能 精子生成障碍精子生成障碍 性欲异常，丧失生育能力性欲异常，丧失生育能力 引起生殖细胞突变，造成可遗传损害引起生殖细胞突变，造成可遗传损害 10 对雌性生
6、殖系统的毒作用对雌性生殖系统的毒作用 对卵巢的损害：对卵巢的损害：卵母细胞数下降/突变；生长卵泡和成熟卵泡降低，排卵抑制，受孕力下降；干扰卵巢内分泌，影响受精/着床/胚胎发育 生殖道的损害：生殖道的损害：影响运送卵子影响运送卵子/受精受精/受精卵发育受精卵发育 对下丘脑对下丘脑-垂体系统的损害：垂体系统的损害：闭经，受孕力降低。闭经，受孕力降低。11 12 是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。二、生殖毒性的评价二、生殖毒性的
7、评价 三段生殖毒性试验三段生殖毒性试验 主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试验大致相当于上述两个阶段。段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）主要反映妊娠前及妊娠初期的情况主要反映妊娠前及妊娠初期的情况 段：肧体段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验）胎体毒性试验（致畸试验）段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、哺乳期的影响。哺乳期的影响。13 段：生育力和早期胚胎发育毒性试验段：生育力和早期胚胎发
8、育毒性试验 （一般生殖毒性试验）（一般生殖毒性试验）目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚 胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖34个动情周期），至妊娠第6天受精卵着床。14 15 受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔 剂量分组：一般设立三个剂量组和两个对照组 高剂量组产生轻微毒性症状高剂量组产生轻微毒性症状，但其死亡率不大于但其死亡率不大于1010%，也也不能完全丧失生育能力不能完全丧失生育能力。相当于相当于1 1/1010LDLD5050。低剂量组则不应产生任何可观察到的损害效应低剂量组
9、则不应产生任何可观察到的损害效应。相当于高相当于高剂量组的剂量组的1 1/3030。中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。如果如果10001000mg/kgmg/kg体重剂量对生育力无损害作用体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利但对生育力无不利影响影响，则可不进行其他剂量实验则可不进行其他剂量实验。一般生殖毒性试验方法原则一般生殖毒性试验方法原则 染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径。交配前雄性动物应染毒交配前雄性动物应染毒4 4-1010周周，雌性动物
10、雌性动物2 2周周 一般可混入饲料或饮水中一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法也可采用灌胃或胶囊法。动物:至少采用一种动物，推荐用大鼠；每组雌雄各20只；雌性动物妊娠13-15天处死，雄性交配成功处死。16 评价方法评价方法 1.1.雄性生殖毒性评价（动物试验）雄性生殖毒性评价（动物试验）精子生成分析（精子计数、形态学及其活率）精子功能检测 睾丸标志酶活性检测 交配实验 显性致死试验 17 18 19 20 三代两窝三代两窝 2.2.雌性生殖毒性评价雌性生殖毒性评价 F F （断奶或出生（断奶或出生8 8 周）周）F Fb b F Fa a F Fb b F Fb b F Fa a F
11、 Fa a 给予受试物给予受试物 8 8 到到12 12 周周 第一次交配第一次交配 第二次交配第二次交配 观察三个月观察三个月，喂饲普通饲料喂饲普通饲料，观察其生长发育情况观察其生长发育情况 2121天断乳后给予受天断乳后给予受试物试物8 8到到1212周周 观察三个月观察三个月，喂饲普通饲料喂饲普通饲料，观察其生长发育情况观察其生长发育情况 2121天断乳后给予受试天断乳后给予受试物物8 8 到到1212 周周 21 两代一窝两代一窝(和一代一窝和一代一窝)生殖试验生殖试验 F F断奶断奶，检查发育情况检查发育情况 F F出生出生，每窝留只幼仔每窝留只幼仔 F F交配交配 断奶断奶，给予受
12、试物给予受试物 F F（每窝选留幼仔只每窝选留幼仔只，雌雄各半雌雄各半）第第-周周 雌雄交配雌雄交配 出生第周给予受试物出生第周给予受试物（F F）22 受孕率受孕率:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况 受孕率妊娠雌性动物数交配雌性动物数受孕率妊娠雌性动物数交配雌性动物数100100 正常分娩率正常分娩率:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响反映雌性动物妊娠过程是否受到影响 幼子出生存活率正常分娩雌性动物数幼子出生存活率正常分娩雌性动物数妊娠动物数妊娠动物数100100 幼仔出生存活率幼仔出生存活率:反映雌性动物分娩过程是否正常反映雌性动物分娩过程是否
13、正常 幼子出生存活率幼子出生存活率出生后出生后4 4天存活幼子天存活幼子数数分娩时出生幼子数分娩时出生幼子数100100 幼仔哺育成活率幼仔哺育成活率:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力 幼子哺乳成活率幼子哺乳成活率2121天断乳幼子存活数天断乳幼子存活数出生后出生后4 4天幼子存活天幼子存活数数100100 观察指标：观察指标：生殖是对亲代动物而言生殖是对亲代动物而言，从配子生成从配子生成、受精到胎受精到胎体分娩是一生殖过程体分娩是一生殖过程。发育主要是对子代而言发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青从受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都属于发育过程春期甚至一
14、直到衰老都属于发育过程。发育毒性也称发育毒性也称为胚胎毒性为胚胎毒性。23 段：胚体段：胚体-胎体毒性试验（致畸试验）胎体毒性试验（致畸试验）24 基本概念基本概念 1.1.发育毒性发育毒性(developmental toxicity)(developmental toxicity)指出生前经父体和指出生前经父体和(或或)母体接触外源性理化因素引起的母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用，在子代到达成体之前出现的有害作用，也称为胚胎毒性也称为胚胎毒性。具。具体表现可分为体表现可分为:生长迟缓生长迟缓:即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，即胚胎与胎仔的发育过程在外源
15、化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。较正常的发育过程缓慢。畸形畸形:由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。器官表现形态结构异常。功能不全功能不全:即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。及行为的缺陷或异常。胚胎死亡胚胎死亡:某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。25 2.2.畸形、畸胎和致畸物畸形、畸胎和致畸物 畸形畸形
16、:器官形态的异常。器官形态的异常。致畸物或致畸原致畸物或致畸原:凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。化合物。畸胎畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。具有畸形的胚胎或胎仔。致畸试验致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。3.3.胚胎毒性作用胚胎毒性作用 外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用的损害作用，对母体无显著的毒效应对母体无显著的毒效应。26 4.4.母体毒性作用母体毒性作用 母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。症伏、直至死亡。母体毒性作用与致畸作用关系母体毒性作用与致畸作用关系 具有致畸作用，但无母体毒性出现。具有致畸作用，但无母体毒性出现。出现致畸作用的同时也表现母体