1、5.3血红蛋白的提取和分离导学案 班级：高二（ ）班 姓名： 【学习目标】1.概述凝胶色谱法、电泳法分离大分子的基本原理。2.知道缓冲溶液的作用。3.尝试对血液中血红蛋白进行提取和分离,体验从复杂体系中提取生物大分子的基础过程和方法。4.掌握对样品的预处理、色谱柱制作及装填等操作,进行样品的加入和洗脱并最终分离出血红蛋白。【自主学习】一、基础知识1.蛋白质的分离依据:蛋白质特性的差异,如分子的形状和_、所带_的性质和多少、溶解度、_和对其他分子的亲和力等。2.凝胶色谱法:(1)概念:也称做_,是根据_分离蛋白质的有效方法。(2)凝胶的特点形态:微小的_组成:大多数由_构成结构:内部有许多_(3
2、)常用凝胶:_和琼脂糖。(4)分离原理。相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程_,移动速度_,通过凝胶的时间_。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶_移动,路程_,移动速度_,通过凝胶的时间_。 3.缓冲溶液:(1)作用:在一定范围内,缓冲溶液能够抵制_对溶液pH的影响,维持pH基本不变。(2)配制:通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_就可以制得_的缓冲液。(3)意义:为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程,保持_与体内环境中的pH基本一致。4.电泳:(1)概念:带电粒子在_的作用下发生_的过程。(2)原理。带电粒子:许多重要的生物大分
3、子,如多肽、核酸等都具有_的基团,在一定的pH下,这些基团会带上_。迁移动力与方向:在电场的作用下,带电分子会向着与其_的电极移动。分离依据:电泳利用了待分离样品中各种分子_以及分子本身的_、_的不同,使带电分子产生_,从而实现样品中各种分子的分离。(3)常用的电泳方法:_电泳和_电泳。 二、实验操作1.样品处理:(1)红细胞的洗涤。目的:去除_。方法:_。标准:直至上清液不再呈现_。(2)血红蛋白的释放。 (3)分离血红蛋白溶液。方法:混合液 分层。分层结果(自上而下):第1层:无色透明的_。第2层:脂溶性物质的_白色薄层固体。 第3层:_的水溶液_透明液体。第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。
4、结果处理:将试管中的液体用_过滤,除去_沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的_液体。2.透析粗分离:(1)过程:取1 mL的_溶液装入_中,将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的_中(pH为7.0),透析_ h。(2)原理:透析袋能使_自由进出,而将_保留在袋内。(3)目的:去除样品中_的杂质。3.凝胶色谱操作纯化:(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色谱柱的装填:凝胶用_充分溶胀后,配成凝胶悬浮液,_缓慢倒入凝胶色谱柱内(3)样品的加入 加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面_，关闭出口加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的_，注意
5、不要破坏凝胶面加样后：打开下端出口，使样品渗入_内(4)洗脱:_下端出口,加入磷酸缓冲液,连接_,_下端出口,进行洗脱4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定:判断纯化的蛋白质是否达到要求,需要进行_的鉴定。鉴定方法中,使用最多的是_。三、操作提示1.红细胞的洗涤:_、离心速度与_十分重要。洗涤次数过少,无法除去_蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果。2.色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在_中膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。3.凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的_,降低_。4.蛋白质的分离:如果
6、红色区带_,说明色谱柱制作成功。【预习小测】1.相对分子质量较大的蛋白质,无法进入凝胶内部的通道,移动速度较慢。( )2.凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。( )3.电泳法分离样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。( )4.红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白,应快速高速离心。( )5.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少。( )6.样品处理和粗分离的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。( )7.若红色区带均匀一致地移动,说明色谱柱制作成功。( )8.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质量和带电性质的差异。( )【合作探究】主
7、题1蛋白质的分离原理及方法1.凝胶色谱法： 结合上图，说出凝胶色谱法分离不同物质的依据并填表比较蛋白质的运动情况。(1)依据：_。(2)蛋白质在凝胶中的运动情况：相对分子质量区别相对分子质量大相对分子质量小运动方式垂直向_运动无规则的_运动运动速度_较慢运动路程_洗脱次序_从凝胶柱中洗脱出来_从凝胶柱中洗脱出来2.电泳：(1)从电荷方面分析适合电泳法分离的各种分子应具备的条件是：各种分子应带有不同_和不同量的_。(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？提示：_。因为SDS能与蛋白质结合，它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的_，因而掩盖了不同蛋白质间的_
8、，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的_决定。主题2血红蛋白的提取与分离实验操作1.实验操作：(1)哺乳动物成熟的红细胞适用于进行蛋白质的分离的原因有哪些？提示：哺乳动物成熟红细胞内没有_和各种复杂的_，排除了其他物质对实验结果的干扰。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。(2)请分析洗涤红细胞的目的，总结判断红细胞洗涤干净的依据。目的：_。依据：_。(3)探究血红蛋白释放过程中蒸馏水和甲苯的作用。蒸馏水的作用：使红细胞_，释放细胞内_；甲苯的作用溶解_，有助于血红蛋白的释放。(4)写出分离血红蛋白混合液的结果。混合液分为4层 第1层(最上层)：_第2
9、层(中上层)：_第3层(中下层)：_第4层(最下层)：_(5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？提示：血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除_的杂质。2.凝胶色谱操作：(1)在制作凝胶色谱柱时，若凝胶色谱柱的高度不足，则_。(2)试从凝胶色谱的分离原理分析凝胶若装填得不够紧密、均匀，则会：在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱_，影响分离的效果。(3)气泡对蛋白质分离产生的影响是_。(4)推测样品洗脱时，红色区带可能会出现哪些情况？提示：如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带_；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的_有关。【探究总结】提取和分离血红蛋白的过程及目的过程目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的杂质蛋白质第 - 4 - 页 共 4 页