1、呼吸道标本的处理程序呼吸道标本的处理程序 王勇 内容简介内容简介 上呼吸道标本标准操作程序（SOP）下呼吸道标本标准操作程序（SOP）痰标本的规范化操作（草案）上呼吸道标本处理程序上呼吸道标本处理程序 大部分步骤需要在生物安全柜内接种 细菌性咽炎的实验室诊断 原理 大多数上呼吸道感染是由病毒引起的。细菌性咽炎经常是由化脓性链球菌引起。但重度的会厌炎和喉气管炎则是例外，其一般是由于b型流感嗜血杆菌引起。标本 从扁桃体和后咽部采集标本的咽拭子 选择性培养基（如表1）5%羊血琼脂 含抗生素的Thayer Martin 琼脂（GC+）和无抗生素的(仅用于淋病奈瑟菌病例)巧克力琼脂（仅用于会厌炎和喉气管
2、炎病例）质量控制 培养基使用之前，QC由培养基组负责。上呼吸道标本处理程序上呼吸道标本处理程序 培养程序 在1/6琼脂表面用力滚动拭子，并划线分离。在一区用接种针穿刺血平板几次。（图1）把平板放置在5%CO2培养。下呼吸道标本的处理 大多数标本需要在安全柜内操作 常规细菌培养 原理原理 下呼吸道感染包括支气管炎，细支气管炎和肺炎。以上炎症，特别是肺炎，可以引起严重甚至是致命的疾病。虽然病毒，支原体，立克次(氏)体和真菌都可以引起下呼吸道感染，但细菌是主要的病原体，其所占的比例要比上呼吸道感染要高很多。下呼吸道标本的处理 下呼吸道标本培养的常见病原菌下呼吸道标本培养的常见病原菌 革兰阳性菌 革兰
3、阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟氏菌 化脓性链球菌 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌 肠杆菌科细菌 结核分支杆菌 非发酵菌 白喉棒状杆菌 嗜肺军团菌 假丝酵母菌 下呼吸道标本的处理 标本标本 痰 气管或经气管壁抽吸物 支气管标本 支气管灌洗液，毛刷，活检标本 下呼吸道标本的处理 材料材料 培养基 5%羊血平板 巧克力平板 中国兰 念珠菌显色培养基 试剂试剂 Sputasol（OXOID）下呼吸道标本的处理 质量控制质量控制 培养基使用之前，QC由培养基组负责。操作程序操作程序 肉眼观察 记录痰标本的外观并记录在申请单背面。外观描述及简写如下：唾液（S）带血（BS）粘液状（M）水样（W）粘液脓性的（M
4、P）脓痰（P）脓性粘液痰（PM）拒收“唾液”标本并报告“标本不适合用于进一步处理”“请重留”下呼吸道标本的处理 显微镜检显微镜检 用拭子取所有类型标本的脓液部分涂片，（最好在60度热固定涂片2小时），并准备革兰染色 低倍镜下检查涂片（10倍目镜）；定量计数10个视野下鳞状上皮细胞和白细胞平均数。按照表1分级标准记录在工作表上。低倍镜下细胞计数（10个视野平均数）倍数倍数 0 偶见偶见 1+2+3+上皮细胞上皮细胞100 无无 2 5 WBC 100 无无 80(或四分之一视野或四分之一视野 20)如果标本要求革兰染色，在如果标本要求革兰染色，在100倍目镜下倍目镜下检查病原体并记录在工作表上检
5、查病原体并记录在工作表上 对涂片显示上皮细胞占优势，（对涂片显示上皮细胞占优势，（3+）丢）丢掉标本并报告掉标本并报告“涂片显示口腔正常菌群涂片显示口腔正常菌群污染污染”“”“标本不适合用于进一步处标本不适合用于进一步处理理”“”“请重留请重留”培养程序 1.水样痰标本水样痰标本 直接接种到培养基，并划线分离 2.脓性标本（特别是痰）脓性标本（特别是痰）-匀浆化 3.Sputasol（OXIDE）的配制 4.无菌操作下，取瓶中的液体1.5ml，加入到18.5 ml无菌水中。无菌条件下2-8至少稳定48小时 痰液化的常规操作程序。痰液化的常规操作程序。痰液中加入等体积的稀释后SPUTASOL 旋
6、涡振荡标本20-30 s，并置室温15分钟 再次旋涡振荡是标本达到进一步液化。准备立即接种标本。用拭子取混悬液到培养基，并划线。5.支气管灌洗液（支气管灌洗液（BAL）的定量培养）的定量培养 6.旋涡振荡BAL并用0.01 ml定量接种环接种到平板上。放置在放置在5%CO2培养箱内培养箱内 您可能每天面临以下问题的挑战您可能每天面临以下问题的挑战 痰标本分离出4种细菌做哪一种细菌的药敏试验？数量很多的凝固酶阴性葡萄球菌在痰里分离出来是否要做药敏?临床微生物实验室规范操作草案 草案分七部分草案分七部分 标本采集和运送的规范条例 培养前标本质量检测规范 标本接种规范条例 细菌鉴定基本流程规范条例
7、细菌药物敏感试验规范条例 实验室质量控制 细菌报告规范条例等 第一部分 标本采集和运送 标本采集和运送是细菌培养成功的最重要标本采集和运送是细菌培养成功的最重要的关键的关键!但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，由此引发的最主要后果是阳性率下降，这也是临床医生最不能接受的问题，为此建议来一次革命，用输送培养基代替传统的标本的容器。痰标本的采集和运送条例 1.标本采集时间：用抗生素前；晨痰;2.采集方法：（1）自然咳痰：用清水漱口3次，应包括咽喉部，用力咳出痰，与灭菌容器中或输送培养基中。痰标本的采集和运送条例（2）帮助咳痰：不易
8、获得痰的患者可雾化吸入加温的氯化钠（4510氯化钠水溶液）（3）支气管镜或支气管毛刷：由医生采集，建议直接种入输送培养基。（4）胃内采集痰标本：婴幼儿不会咳痰而且常把痰误咽入胃中。可在清晨，用胃管插入胃内，用注射器抽出胃液。（5）小儿采集痰标本：用压舌板刺激咳嗽使肺部和器官的分泌物喷出，用拭子采取标本送检，如不能立即送检应种入输送培养基。厌氧培养标本采集规范条例 1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养 3.便标本厌氧培养标本采集;可用排出的便作厌氧培养但也应少与空气接触。
9、第二部分标本培养前规范草案 合格的标本是培养成功的最重要的因素，实验室有权利对不合格提出终止检查或要求重送标本的要求，因此实验室必须建立标本接种前的质量控制和标本合格的检测。要求对除血液外的标本均作涂片革兰染色检查，用于评价标本的质量和区别分离细菌是定植菌或致病菌。痰培养标本培养前规范 实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上皮细胞大于25个每视野时应作为不宜作培养的标本 当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌分布作判断；痰培养标本培养前规范 当标本中细菌种类超过3种以上，未见到纤毛柱状上皮细胞，作为不合格标本；如见到数量不
10、等的白细胞或纤毛柱状上皮细胞或两者同在，含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析；当涂片中见到1-3种细菌，少量的扁平上皮细胞，少量或较多纤毛柱状上皮细胞均可按合格标本继续培养。厌氧培养 在正常上班时间。申请厌氧培养的可适应邀请实验室，由临床医生或护士采集，细菌室行床边接种。自然排出的便标本和尿标本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰标本均为不合格的厌氧培养标本，应于退检。没有条件或不能及时送检的情况下均应用输送培养基放置标本。培养结果结合涂片判断定置菌或致病菌 1、尿培养分离出3种以上的细菌，或分离出凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌，涂片未见到，应
11、在报告中提示可能是污染细菌建议结合临床表现考虑结果的参考价值。2、眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。培养结果结合涂片判断定置菌或致病菌 3、前列腺液标本分离出凝固酶阴性葡萄球菌或革兰阳性小杆菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。4、当涂片中见到的细菌，并由细菌吞嗜现象存在，在培养时分离出该细菌可推测为致病菌。（涂片应注明细菌是细胞内或细胞外）培养结果结合涂片判断定置菌或致病菌 5、涂片报告的日期和培养报告日期要对应便于医生判别结果的参考价值。6、并每一视野可见到20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%，可推测是标本中的优势菌。第三部分 分离
12、培养规范草案 有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病菌分离成功。一、痰培养 1.培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、加MRSA显色琼脂。2.培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂置5-7%CO235环境培养、其他培养置35空气培养。3.结核培养：罗世鸡蛋斜面，每一标本种2支，37度空气培养 第四部分 细菌鉴定规范草案 当分离到细菌后进行鉴定分类是十分必要的，由于各级医院所具有的技术水平、设备条件差异，但对菌株的鉴定应包括以下基本步骤：涂片染色 一、涂片染色：应具备最基本的两
13、种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色 1、革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，是葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。2、抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。趋向性鉴定试验 革兰阳性球菌：触酶试验、凝固酶试验 革兰阴性杆菌：氧化酶试验 生化试验 应包括临床常见分离致病菌的生物特征；有条件的实验室建议购买商品鉴定系统，根据标本量选择手工操作的API系统或半自动的ATB系统或全自动的VITEK
14、-2COMPACT，或PHENIX-100等，无条件的实验室可自行配制生化试剂，但应有质量控制记录保证试剂的实效性。血清学试验 肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。血清学鉴定 1.志贺氏菌多价和单价凝集血清 2.沙门氏菌多价和单价凝集血清 3.致病性大肠杆菌多价和单价凝集血清 4.耶尔森氏菌凝集血清 真菌检测 1.每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别曲菌或毛霉菌 2.开展真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基 真菌检测 3.真菌鉴定应区别是白色念珠菌或非白色念珠菌；是曲菌或毛霉菌，可用显色
15、培养基或传统手工鉴定厚膜孢子的方法，对丝状真菌用小培养观察生长过程初步鉴定真菌种并区别曲菌或毛霉菌。有条件的实验室也可用自动化设备或分子生物学方法作鉴定。4.有条件的单位可开展真菌药敏试验（应用稀释法报告MIC结果），真菌耐药监测为临床用药提供参考。第五部分 药物敏感试验规范 基层细菌室应开展K-B纸片扩散法药敏试验，应用WHONET软件开展本单位的耐药监测为临床用药提供参考 药敏标准药敏标准 1.用CLSI指南推荐的K-B药敏标准进行常规药敏试验判断 2.根据CLSI更新及时替换应用的标准 3.根据CLSI推荐的方法，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。药敏方法
16、1.K-B纸片扩散药敏方法作为常规药敏方法。2.CLSI没有设定标准的抗生素应用稀释法报告MIC结果。药敏试验的质量控制 1.1.初始质量控制应换初始质量控制应换CLSICLSI要求连续要求连续3030天直到天直到失控小于失控小于3 3次为止。次为止。2.2.常规药敏质量控制应保持每周一次。常规药敏质量控制应保持每周一次。3.3.发生失控后应按发生失控后应按CLSICLSI程序纠控，选择对失程序纠控，选择对失控抗生素的标准菌株，做纸片扩散药敏，控抗生素的标准菌株，做纸片扩散药敏，同一药物贴同一药物贴5 5张纸片，连续测试张纸片，连续测试5 5天，寻找天，寻找原因，纠正错误。如第一天已找到合理的原因，纠正错误。如第一天已找到合理的原因，可提前恢复常规药敏质控。原因，可提前恢复常规药敏质控。第六部分 临床微生物实验室的质量控制 质量控制是保证实验室检测结果正确的重要措施，质量指控包括室内和室间质量控制。参加室间质量控制有利于发现实验室的系统误差，是对室内质量控制的评价，因此二级或以下医院细菌室应参加本省或本市的临床细菌室的定期的质量控制活动。第七部分 临床细菌室报告制度的规范 细菌实验室应