1、MTT法检测细胞活力法检测细胞活力 甘肃中医药大学甘肃中医药大学 MTT法目的和意义法目的和意义 检测细胞存活和生长情况检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用用于评价药物产生的细胞毒作用 原理原理 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶）能溶解细胞中的
2、紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。在一定细胞数范围内，在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正结晶物形成的量与活细胞数成正比。比。活细胞+MTT 琥珀酸脱琥珀酸脱 氢酶氢酶 紫蓝色结晶物 Formazan 贴壁细胞操作步骤贴壁细胞操作步骤 1.接种细胞：用接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成清的培养液配成单个细胞悬液单个细胞悬液，以每孔，以每孔2000-3000
3、个细胞接个细胞接种于种于96孔培养板中，每孔体积孔培养板中，每孔体积90 ul。（边缘孔用（边缘孔用PBS或空白或空白培养基填充）。培养基填充）。2.培养细胞：将培养板移入培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在孵箱中，在37、5%CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板孔平底板，大约，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药可加药，每孔加药10 ul，一般设，一般设5个复孔。个复孔。3.5%CO2，37孵育分别孵育孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观小时后，
4、倒置显微镜下观察。察。4.每孔加入每孔加入10ul MTT溶液（溶液（5mg/ml，即，即0.5%MTT），继续），继续培养培养4h。若药物与。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用心用PBS冲冲2-3遍后，再加入含遍后，再加入含MTT的培养液。的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入每孔加入100ul二甲基亚砜（置摇床上低速振荡二甲基亚砜（置摇床上低速振荡10min，使，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸处测量各孔的吸光值。光值。7.同时设
5、置调零孔（培养基、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）、二甲基亚砜）悬浮细胞操作步骤悬浮细胞操作步骤：1）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1104/ml，每孔先加，每孔先加细胞悬液细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔相应梯度的药物每孔10ul；共；共100ul加入到加入到96孔板（边缘孔板（边缘孔用孔用PBS填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、MTT、二、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、甲基亚砜），对照孔
6、（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），、二甲基亚砜），每组设每组设5个个复孔。复孔。2）置）置37，5%CO2孵育孵育24小时，倒置显微镜下观察。小时，倒置显微镜下观察。3）每孔加入）每孔加入10 ul MTT溶液（溶液（5 mg/ml，即，即0.5%MTT），继续培养），继续培养4 h 4）每孔加三联裂解液（每孔加三联裂解液（10gSDS，异丁醇异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸用双蒸水溶解配成水溶解配成100ml）过夜，）过夜，第二天早晨置摇床上低速振荡第二天早晨置摇床上低速振荡10 min，使，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测
7、量各孔的吸光值。测量各孔的吸光值。药物的配制 浓度 体积 过滤 MTT的配制的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后一般最好现用现配，过滤后4 C避光保存两周内有效，或配制成避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿变为灰绿色时就绝对不能再用了。色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套有条件最好带那种透明的簿膜手套.配配成的成
8、的MTT需要无菌，需要无菌，MTT对菌很敏感；往对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。关系，因为时间较短。实验结果统计学处理 所有数值以xs表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度）。或计算抑制率。OD对照组-OD实验组 抑制率%=OD对照组 100%实验结果统计学处理 公式如下：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 P
9、n:最小阳性反应率 举例 药物浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025 注意事项注意事项 1 选择适当的细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。在进行在进行MT
10、T试验前，对每试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。培养时间。2 设空白对照，设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。实验前应明确的问题实验前应明确的问题 1.选择适当的细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，一般情况下，96孔培养孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有板的一内贴壁细胞长满时约有10
11、5个细胞。但由于不同细胞个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。降低，太少观察不到差异。2.药物浓
12、度的设定。药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。度根本不是药物的有效浓度和时间。3.时间点的设定。时间点的设定。在不同时间点的测定在不同时间点的测定OD值，输入值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个化的曲线，
13、曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。抑制表现的最明显）。4.培养时间。培养时间。100ul的培养液对于的培养液对于10的的45次方的增次方的增殖期细胞来说，很难维持殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，期而趋于静止，影响结果，我们是在我们是在48h换液的。换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。能测定细胞绝对数
14、。做做MTT时，尽量无菌操作，因时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致为细菌也可以导致MTT比色比色OD值的升高。值的升高。7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加调零孔加培养基、培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。避免血清干扰。用含用含15胎牛血清培养液培养细胞时，胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试
15、验孔的光吸收值。由于试验本底增高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于加，会试验敏感性。因此，一般选小于10胎牛血清的培胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。关于细胞的接种关于细胞的接种(铺板铺板)细胞过了细胞过了30代以后就不要用了代以后就不要用了;培养板要用好的（最好进口培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种接种时最好按照预实验摸索出的密度接种,且而细胞过密或且而细胞过密或
16、者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而。故而MTT细胞密度多采用细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定。细胞密度要根据不同细胞的特点来定。悬浮细胞每孔的细悬浮细胞每孔的细胞数可达到胞数可达到105,贴壁细胞可为贴壁细胞可为103-104。MTT本身就是比较粗的实验，增殖率本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不左右的波动都不算奇怪。特别是新手，算奇怪。特别是新手，20的波动也是常见的，所以很可的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关种板技术一定要过关。注意注意细胞悬液一定要混匀细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。多也会影响细胞活力。所