1、乙肝两对半测定 酶联免疫法 实习生：廖於波 指导老师：李海龙 HBV是乙型病毒性肝炎的病原体。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。乙肝病毒血清标志物 HBsAg 第一个出现，感染后1-2周即可阳性 阳性表示存在HBV感染 HBsAb 出现在HBsAg消失后 保护性抗体 疫苗免疫成功的标志 乙肝病毒血清标志物 HBeAg 病毒复制标志 传染性强 HBeAb 传染性降低 长期存在是D
2、NA与肝细胞整合的结果 乙肝病毒血清标志物 HBcAg HBV复制的标志 血清中难以检测出来 IgM-HBcAb 急性HBV感染 IgG-HBcAb 急性感染恢复期和慢性持续感染 检测HBV病毒血清标志物是临床最常用的病原学诊断方法。HBV具有三个抗原抗体系统，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗体（HBeAb）、核心抗原（HBcAg）核心抗体（HBcAb），由于HBcAg在血液中难于检出，故临床免疫学检测不包括HBcAg，目前常采用酶联免疫法和化学发光法检测。酶联免疫吸附实验原理 用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并
3、将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。乙肝病毒血清标志物检测原理 血清学标志 原理 包被试剂 标记或结合物 结果判断 HBsAg 夹心法 HBsAb HBsAb 显色(+)HBsAb 夹心法 HBsAg HBsAg 显色(+)HBeAg 夹心法 HBeAb HBeAb 显色(+)HBeAb 竞争法 HBeAb HBeAb及中和抗原 不显色(+)HBcAb 竞争法 HBcAg HBcAb 不显色(+)标本本要求 采集：血浆：使用抗凝血浆管（枸橼酸
4、盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂）采集样品。样品离心分离后，提取血浆用于检测。血清：采用正确医用技术采集标本。离心分离后，提取血清样品用于检测。标本要求 储存：样品可存放于28冰箱，24小时内测定。若需长时间保存，则应冻存于-20以下，避免反复冻融。上述样品使用前应恢复到室温，轻轻摇动混匀。若标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。严重融血或脂血标本不可使用。试剂（安图生物）编号编号 组分名称组分名称 96人份人份 1 包被板 69孔X1块 2 样品稀释液 2.3ml X1瓶 3 酶结合物 5.5ml X1瓶 4 底物液 6.2ml X1瓶 5 显色剂 6.2ml X1瓶 6 洗涤
5、液 30ml X1瓶 7 终止液 5.5ml X1瓶 8 阴性对照 1.0ml X1瓶 9 阳性对照 1.0ml X1瓶 10 子母袋 1个 11 说明书 1份 12 板贴 3张 主要组成成分主要组成成分 实验前准备 1.取出试剂盒及待测样品，将所有试剂及样品恢复至室温（1825）。2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用。检验步骤 排板 检验步骤 表面抗原（两步法）1.留一孔作空白对照，加入样本稀释液20ul/孔（含空白孔），其他加入阴性对照三孔和阳性对照二孔100ul/孔及待测标本100ul/孔于相应的反应孔内。2.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该
6、步骤非常重要）。3.贴上板贴，置37下温育60分钟。检验步骤 4.撕下板贴，除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。5.在微型振荡器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。6.贴上板贴，置37下温育30分钟。7.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。8.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37避光温育30分钟。检验步骤 9.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。10.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。检验步骤 表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体（一步法）1.留一孔空白，三孔加入阴性对照、二孔加入阳性对照各50ul/孔，其他各孔分别加入样本50ul(HBcAb测定
7、时待测血清用生理盐水1:30稀释50ul血清+1.5ml生理盐水)。2.除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。3.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。4.贴上板贴，置37下温育30分钟。检验步骤 5.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。6.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37避光反应10分钟。7.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。8.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。结果判定 血清学标志 原理 包被试剂 标记或结合物 结果判断 HBsAg 夹心法 HBsAb HBsAb 显色(+)HBsAb 夹心法 HBsAg HBsAg 显色(+)
8、HBeAg 夹心法 HBeAb HBeAb 显色(+)HBeAb 竞争法 HBeAb HBeAb及中和抗原 不显色(+)HBcAb 竞争法 HBcAg HBcAb 不显色(+)1.肉眼判定 结果判定 2.酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值，根据OD值判定结果 注意事项 浓缩洗涤液配制前充分摇匀。加样本时要加到孔底。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。注意事项 滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。洗涤时各孔须加满，防止孔口内有游离酶残留。洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。脂血，溶血可影响结果。注意
9、事项 所有样本都应按传染源处理。样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。影响检测结果的因素 1.样本采集与处理的影响 1.1 标本严重溶血。1.2 标本凝固不全：血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋原。2、试剂的影响 2.1 不同批号。2.2 不同厂家。影响检测结果的因素 3.操作技术的影响 3.1 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。3.2 温浴影响。3.3 手洗条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。常见
10、模式及临床意义 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临 床 意 义+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV复制，传染性强大三阳大三阳 +急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者；传染性弱小三阳小三阳 +急性HBV感染；慢性HBsAg携带者；传染性弱+慢性HBsAg携带者易转阴；急性HBV感染趋向恢复+急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强+急性HBV感染早期；急性HBV感染潜伏期；慢性HBV携带者，传染性弱 常见模式及临床意义 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临 床 意 义 +非典型性或亚临床型HBV感染 +注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假阳性 +急性HBV感染后康复 +HBV感染后已恢复 +既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复期 +既往感染未能测出HBsAb；恢复期HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症状HBsAg携带者 过去和现在未感染过HBV