1、HBcAg的检测与应用的检测与应用 检验科检验科 胡亚远胡亚远 摘要 HBcAg存在于Dane颗粒的核心，是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，具有重要的生物学特性和临床病理意义，HBcAg由HBV基因组的C开放读码区（ORF）编码，具有高度免疫原性，对HBcAg的免疫应答在病毒清除中有重要作用。血清HBcAg阳性可提供肝内HBV合成的信息，是病毒存在的直接标志，HBcAg感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后HBcAg可直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。检测肝组织HBcAg有助于确定乙型肝炎病原学诊断和评估肝细胞坏死炎性活动的程度及病变发展的趋向，推测慢性乙型肝
2、炎的预后。血清和肝组织HBcAg检测具有多种实用价值，值得推荐。0 引言 乙型肝炎病毒（HBV）是嗜肝DNA病毒，完整的HBV颗粒又称Dane颗粒，球形，直径约42urn。HBV核心抗原（Hepatitis B Core Antigen，HBcAg）存在于Dane颗粒的核心，是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，主要存在于受感染的肝细胞核内，它反映血清中Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制。存在于乙型肝炎患者血液和肝组织内的HBcAg具有重要的生物学特性和临床病理意义。1 生物学特性 1.1一般特性 HBcAg由HBV基因组的C开放读码区（ORF）编码，从第二个ATG（1 901 nt）起始翻译（
3、终止密码子在2 458 nt）。HBcAg有保守的三维结构，可因血清型不同而有183-185个氨基酸残基（aa），相对分子质量Mr21,000，180个HBcAg形成27nrn的正20面体以构成核心颗粒。HBV核心部分含有环状双股DNA、DNA聚合酶、HBcAg和e抗原（HBeAg），是病毒复制的主体。HBcAg包装HBV DNA，在病毒成熟过程中起重要作用。HBcAg己被证明含有HBV特异性DNA聚合酶，是HBV复制的标志。1.1一般特性一般特性 HBcAg可在受染的肝细胞核中查到，但它主要在胞质中产生，由胞核定位序列（nuclear localization sequences，NLS）介
4、导HBcAg进人细胞核中。胞核定位序列位于HBcAg的羧基末端区（C端区）第145-156位和第172-183位的氨基酸序列，具有与细胞核特异性结合，并将与之相连的蛋白或DNA转运到细胞核中的功能。1.2免疫反应 HBcAg具有高度免疫原性，在T细胞和B细胞水平上，HBcAg的抗原性较HBeAg强100倍，几乎所有HBV感染者都产生抗-HBc，同时有T细胞免疫应答。对HBcAg的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用。这对HBcAg DNA的疫苗研究有重要的指导意义。1.2免疫反应 Th细胞根据其的分泌细胞因子不同可分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要产生白介素-2（IL-2），干扰素（IFN）
5、和肿瘤坏死因子（TNF）等促进细胞免疫反应；Th2细胞主要产生白介素-6（IL-6）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）等促进体液免疫反应。Th1和Th2细胞通过分泌的细胞因子相互下调对方的生长分化，刺激自身的增生。1.2免疫反应 机体的机体的Th1型免疫反应可促进病原体的清除，而型免疫反应可促进病原体的清除，而Th2型免疫反应则可加重机体的病理损害，在型免疫反应则可加重机体的病理损害，在HBcAg诱导下，外周血单个核细胞（诱导下，外周血单个核细胞（PBMC）产生）产生Th1类细类细胞因子量明显增高；在胞因子量明显增高；在HBeAg诱导下，诱导下，Th2类细胞因类细胞因子量明显
6、增高。慢性子量明显增高。慢性HBV感染进行免疫调节治疗的感染进行免疫调节治疗的一个目标就是使一个目标就是使HBeAg特异性特异性T细胞由细胞由Th2细胞主导细胞主导型转化为型转化为Th1细胞型，细胞型，HBcAg有望打破有望打破HBeAg诱导的诱导的免疫耐受状态而增强免疫耐受状态而增强Th1细胞优势表达达到治疗的目细胞优势表达达到治疗的目的。慢性乙型肝炎患者和的。慢性乙型肝炎患者和HBV慢性携带者体内针对慢性携带者体内针对HBV的特异性的特异性CTL应答明显低下，纠正这种应答明显低下，纠正这种CTL低低反应状态，对于机体有效地清除反应状态，对于机体有效地清除HBV至关重要。至关重要。1.2免疫
7、反应 DNA疫苗（基因疫苗）是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，它作为一种全新的高效免疫方法，己在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出较好的应用前景。DNA疫苗可刺激机体特异性CTL功能的特性给HBV慢性持续感染的治疗带来新的希望。1.2免疫反应 采用治疗性疫苗打破宿主对HBV的免疫耐受状态来治疗慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎病毒携带者是一新的有效途径。HBV核心抗原区AA1-AA151段含有多个不连续的抗原表位，对刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫均具有重要作用。Kuhober和Geissier et al作了HBcAg DNA疫苗肌内注射
8、法免疫小鼠的初步观察。该DNA疫苗具有良好的细胞免疫原性，确可刺激宿主产生较强的CTL反应。这一结果为我们进一步探索该DNA疫苗在治疗主要因机体CTL功能低下所致HBV慢性持续感染方面的应用前景奠定了初步的实验研究基础。2 临床应用 2.1血清HBcAg HBsAg、HBeAg、抗-HBc等免疫学指标都是体内存在乙型肝炎病毒颗粒的间接标志，而HBcAg则是HBV存在的直接标志。所以，HBcAg测定更能反映HBV的存在及其复制程度，比其他各种免疫学指标更灵敏、更特异。HBcAg是乙型肝炎病毒（HBV）的核心成分，若在血清中检出HBcAg则说明有HBV复制。血中的HBcAg是作为Dane颗粒内部成
9、分存在，极少有游离的HBcAg，故用常规方法不易检出，在血清中不能直接检出HBcAg，需加用开壳剂，使HBcAg释放于溶液中然后进行测定。检测HBcAg，目前多采用间接的方法，即首先在试管内将Dane颗粒沉淀，再用裂解剂裂解Dane颗粒外壳，使HBcAg暴露游离，并经过多次洗涤处理后，用放免或酶免方法检测。如用EIA微板法检测血清HBcAg，被检标本不须任何处理，直接在微孔板内进行检测，应用于临床，可与乙型肝炎病毒标志物同步检测。2.1.1检测 2.1.2血HBcAg与HBsAg的关系 HBcAg出现的阳性率与HBsAg的出现密切相关，往往HBcAg（）与HBsAg（）同时存在，而HBsAg（
10、）时不一定会出现HBcAg（）。抗-HBs的出现并不标志着HBV复制的中止，而是复制水平减低。不能以HBsAg阴性就排除HBV感染，临床上HBsAg阴性的患者，只要HBcAg检出阳性，说明仍有乙型肝炎病毒复制。以往认为血清中仅HBsAg阳性者，病毒为非复制相，无传染性，但这种患者中，也有检测出HBcAg、HBV DNA阳性者，故判断单项血清HBsAg阳性者的传染性时应慎重。2.1.3血HBcAg与e系统的关系 HBeAg阳性是HBV持续高水平复制和传染性强的标志，其与HBcAg、HBV DNA密切相关，并具有明显的平行关系。多年来，一直认为e抗原是复制标记物，由于HBeAg是HBcAg的降解产
11、物，以可溶性蛋白形式存在，在结构上不及HBcAg与病毒颗粒关系密切，对判断病毒复制、评估传染性不及HBcAg敏感可靠。2.1.3血HBcAg与e系统的关系 一般认为，当HBeAg/抗-HBe转换后，HBV复制趋于减少，没有传染性或传染性很小。HBeAg被公认为是HBV复制的标志物。但部分阴性者HBeAg的血清中仍可检出HBcAg和（或）HBV DNA，说明HBeAg的表达可能不是HBV复制的必然结果，对HBeAg阴性感染者的带毒状态及抗-HBe表达的临床意义必须重新认识，不能忽视其具有传染性的可能。2.1.4血HBcAg与HBV DNA、HBV DNA-P的关系 在慢性乙型肝炎患者中，血HBc
12、Ag与血HBV DNA有很好的相关性；而在急性期，尤其是在肝损害极期时，往往血HBcAg阳性，而血HBV DNA阴性，考虑为HBcAg从受免疫损伤的被感染的肝细胞内释放入血，这种情况甚至在病毒已终止复制后也可出现。对HBsAg慢性携带状态患者，判断HBV复制及传染性，HBcAg的敏感性最高，HBV DNA和HBV DNA-P次之，HBeAg敏感性低。2.1.5不同肝病的检出率 慢性活动性肝炎中血慢性活动性肝炎中血HBcAg阳性率阳性率明显高于明显高于ASC（无症状病毒携带者），（无症状病毒携带者），说明血说明血HBcAg阳性较多见于病变活动较阳性较多见于病变活动较重的慢性肝炎而较少见于病变较静
13、止的重的慢性肝炎而较少见于病变较静止的ASC。血清中的。血清中的HBcAg阳性与肝脏病变阳性与肝脏病变活动程度有关，且对估计预后有很好价活动程度有关，且对估计预后有很好价值。值。HBcAg检出结果是：肝硬化慢性检出结果是：肝硬化慢性乙型肝炎中型慢性乙型肝炎轻型。乙型肝炎中型慢性乙型肝炎轻型。2.1.6检测血HBcAg的临床意义 （1）对血液内）对血液内HBV的开壳处理，能直接检的开壳处理，能直接检测测HBcAg，能比，能比HBeAg更客观地反映血更客观地反映血HBV的的存在，以及作出数量多少的判断，可替代存在，以及作出数量多少的判断，可替代HBeAg而作为病毒复制和传染性的敏感指标，是病毒存而
14、作为病毒复制和传染性的敏感指标，是病毒存在的直接标志。它与在的直接标志。它与HBV复制标志呈正相关，可复制标志呈正相关，可以反映以反映HBV活动的复制程度。活动的复制程度。HBcAg与乙型肝与乙型肝炎病毒其他五项标志物相比更是反映炎病毒其他五项标志物相比更是反映HBV复制的复制的直接证据。它可与其他的直接证据。它可与其他的HBV血清学标志物起到血清学标志物起到相互配合和相互补充的作用。相互配合和相互补充的作用。2.1.6检测血HBcAg的临床意义 （2）有助于对乙型肝炎病情和预后的判断，）有助于对乙型肝炎病情和预后的判断，HBcAg感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细感染的肝细胞是细胞免疫效应
15、攻击的靶细胞，肝细胞溶解后胞，肝细胞溶解后HBcAg可直接释放入血，故能可直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。在急性直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。在急性乙型肝炎早期乙型肝炎早期HBcAg亦达高峰值，而且病情严重亦达高峰值，而且病情严重者的者的HBcAg水平也相应提高。慢性乙型肝炎患者水平也相应提高。慢性乙型肝炎患者，血，血HBcAg阴性者比阳性者有明显的临床及生化阴性者比阳性者有明显的临床及生化指标的改善。指标的改善。HBcAg含量与肝脏损害的情况有关含量与肝脏损害的情况有关，有助于抗病毒药物及免疫治疗的疗效评价。，有助于抗病毒药物及免疫治疗的疗效评价。2.1.6检测血
16、HBcAg的临床意义 （3）从理论上讲，聚合酶链反应（）从理论上讲，聚合酶链反应（PCR）检）检测法比固相放射免疫法灵敏度高，但实际上可出测法比固相放射免疫法灵敏度高，但实际上可出现现HBcAg阳性而阳性而HBV DNA阴性的结果。因此，两阴性的结果。因此，两种检测方法可以互补使用，以减少漏检。在不具种检测方法可以互补使用，以减少漏检。在不具备备PCR检测条件的单位，以酶联（检测条件的单位，以酶联（ELISA）法试）法试剂盒在检测血清剂盒在检测血清HBV五项标志的同时，检测五项标志的同时，检测HBcAg不仅能进一步了解病毒的复制情况，还可不仅能进一步了解病毒的复制情况，还可了解肝细胞损害和病情进展的程度，且检测费用了解肝细胞损害和病情进展的程度，且检测费用低廉，有临床实用价值。低廉，有临床实用价值。2.1.6检测血HBcAg的临床意义 （4）在对献血员的筛选中在对献血员的筛选中，单凭单凭HBsAg的测定来判断是否受的测定来判断是否受HBV感染也是不够的感染也是不够的，会漏诊会漏诊HBsAg阴性而阴性而HBcAg和抗和抗-HBc阳阳性的乙型肝炎患者性的乙型肝炎患者，只有三者同时检测只有三