1、基因工程基因工程 背景：背景：家蚕能够吐出蚕家蚕能够吐出蚕丝为人类利用。但繁殖慢，丝为人类利用。但繁殖慢，产量低。产量低。能否让大肠杆菌也能吐蚕丝呢？能否让大肠杆菌也能吐蚕丝呢？大肠杆菌繁殖很快，但不大肠杆菌繁殖很快，但不会产丝。会产丝。用人工方法，把甲生物的某个基因提取用人工方法，把甲生物的某个基因提取出来，在体出来，在体外进行外进行切割、拼接和重组切割、拼接和重组，然后将其，然后将其导入导入乙生物的乙生物的细胞内进行大量细胞内进行大量复制复制，并进行，并进行表达表达，从而定向地改，从而定向地改变乙生物的遗传性状，或获得人类所需要的基因变乙生物的遗传性状，或获得人类所需要的基因产产物物（蛋白
2、质、多肽、酶）。（蛋白质、多肽、酶）。剪切拼接导入剪切拼接导入 甲甲 生生物物 取出所需基因取出所需基因 生物生物 新类型新类型 表达表达 新的新的生物生物产品产品 乙乙 生生物物 基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：行基因操作最少需要以下三种工具：、基因的手术刀、基因的手术刀 、基因的针线、基因的针线 3 3、基因的运输工具、基因的运输工具 主要在主要在原核生物原核生物中。中。特异性特异性。即一种限制性内切酶只能识。即一种限制性内切酶只能
3、识别一种特定的核苷酸序列，并在特定别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将的切割点上将DNA分子切断分子切断（使连接使连接脱氧核苷酸的脱氧核苷酸的磷酸二酯键磷酸二酯键断裂）断裂）。已发现数千种已发现数千种 种类种类:来源来源:特点特点:、基因的剪刀基因的剪刀 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 例如：大肠杆菌的一种限制酶能识别例如：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在序列，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶 G A A T T CG A A T T C C T T A A GC T T A A G 5 5 3 3 粘性末端粘性末端 粘性末端粘性末端 限制性限制性内切酶内
4、切酶 C T T A AC T T A A GG 5 3 A A T T CA A T T C GG 3 5 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们几个伸出的核苷酸，他们两个两个之间正好之间正好反向反向互互补配对，这样的切口叫粘性末端。补配对，这样的切口叫粘性末端。被同一种限被同一种限制酶切断的几个制酶切断的几个DNA就具有相同的粘性末端，就具有相同的粘性末端，能够通过互补进行配对。能够通过互补进行配对。T G C AT G C A A C G TA C G T 5 3 3 5 不同的限制酶所形不同的限制酶所形成的粘性末端不同成的粘性末
5、端不同 A C GA C G T T 5 3 G C AG C A T T 3 5 另一种另一种限制酶限制酶、基因的针线、基因的针线 作用：作用：将粘性末端碱基互补的两个将粘性末端碱基互补的两个DNA片段片段连接起来，使之成为一个完整的连接起来，使之成为一个完整的DNA分子分子（使两个（使两个DNA片段通过片段通过磷酸二酯磷酸二酯键键连接成一个连接成一个DNA分子）分子）。DNA连接酶连接酶 C T T A AC T T A A GG A A T T CA A T T C GG 连接酶连接酶 3 3、基因的运输、基因的运输 工具工具 基因载体的条件：基因载体的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地
6、保存。能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。具有多个限制酶切点（具有多个限制酶切点（每种限制酶切点每种限制酶切点只有一个只有一个），以便与外源基因连接。），以便与外源基因连接。具有标记基因，便于进行筛选。具有标记基因，便于进行筛选。载体载体 要把甲生物取出的基因送到乙生物的细胞中去，要把甲生物取出的基因送到乙生物的细胞中去，需要运输基因的载体。需要运输基因的载体。最常用的基因载体是细菌细胞质的最常用的基因载体是细菌细胞质的质粒质粒（核区）（核区）质粒（细胞质质粒（细胞质DNA）大肠杆菌大肠杆菌 质粒质粒能能自主复制自主复制的的双链环状双链环状DNA分子，分子，存在于细菌存在于细菌核区核区以外，以外
7、，带有少量基因，其中带有少量基因，其中常含常含有有抗生素抗性基因（如抗生素抗性基因（如四环素的抗性基因）四环素的抗性基因），使细菌有抗药性，一个细菌中有，使细菌有抗药性，一个细菌中有多个质粒。多个质粒。最常用的基因载体是细菌细胞质的最常用的基因载体是细菌细胞质的质粒质粒（核区）（核区）质粒（细胞质质粒（细胞质DNA）大肠杆菌大肠杆菌 质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：1、质粒的存在对宿主细胞、质粒的存在对宿主细胞无影响无影响。2、质粒的复制、质粒的复制只能只能在宿主细胞内完成。在宿主细胞内完成。抗生素抗性基因（标抗生素抗性基因（标记基因）记基因）（细胞质（细胞质DNA）（核区）（核区
8、）质粒质粒(细胞质细胞质DNA)大肠杆菌大肠杆菌 控制质粒控制质粒DNA转转移的基因移的基因 4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞 1 1、获得目的基因、获得目的基因 2、形成重组、形成重组DNA分子分子 3 3、将、将重组重组DNA分子分子导入受体细胞导入受体细胞 5 5、目的基因的表达、目的基因的表达 第二节第二节 基因工程的原理和技术基因工程的原理和技术 基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟 逆转录法：逆转录法：信使信使RNARNA 逆转录酶逆转录酶 DNADNA单链单链 合成合成 DNADNA双链双链 (基因基因)直接合成法：直接合成法：组成蛋白质的组
9、成蛋白质的氨基酸序列氨基酸序列 推测推测 信使信使RNARNA 核苷酸序列核苷酸序列 推测推测 基因单核基因单核 苷酸序列苷酸序列 合成合成 基因双链基因双链 、获得目的基因、获得目的基因 （1 1）化学合成法）化学合成法（目的基因的序列（目的基因的序列巳知巳知）人工合成人工合成 (基因比较小基因比较小)DNA合成仪合成仪（2 2）用聚合酶链式反应）用聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增目的基因扩增目的基因 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min）温度（）PCR反应 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复13步 2530轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA
10、双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍（3 3）从基因文库中分离：）从基因文库中分离：目的基因的脱氧核苷酸序列是目的基因的脱氧核苷酸序列是未知的未知的，可以从基因文库中找到目的基因（酶切）。可以从基因文库中找到目的基因（酶切）。（2 2）用聚合酶链式反应）用聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增目的基因扩增目的基因 基因组文库的构建模式图基因组文库的构建模式图 通过对通过对 受体菌受体菌 的培养而的培养而储存基因储存基因 2、形成重组、形成重组DNA分子分子 用用相同相同的限制性核的限制性核酸内切酶分别切割目的酸内切酶分别切割目的基因和载体；基因和载体；
11、目的基因与载体的结合过程目的基因与载体的结合过程基因重组基因重组 用用DNA连接酶将目连接酶将目的基因和载体连接在一的基因和载体连接在一起，形成重组起，形成重组DNA分子分子（或重组质粒）。（或重组质粒）。3、将重组、将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 导入导入 扩增扩增 将重组将重组DNA分子导入受体细胞并使之扩增。分子导入受体细胞并使之扩增。a a、为使、为使重组的质粒更容易进入大肠杆菌重组的质粒更容易进入大肠杆菌，用，用氯化钙氯化钙处处理大肠杆菌，理大肠杆菌，增加增加大肠杆菌大肠杆菌细胞壁的通透性细胞壁的通透性。a.如要获得目的基因的如要获得目的基因的表达产物，表达产物，通常以
12、大肠杆菌等无害易得的细通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。菌为受体。b.如要如要改良某种生物的性状改良某种生物的性状时，时，要以改良的生物细胞为受体。要以改良的生物细胞为受体。问题：谁是受体？问题：谁是受体？3、将重组、将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 将重组将重组DNA分子导入受体细胞并使之扩增。分子导入受体细胞并使之扩增。1 1、受体为植物细胞：农杆菌介导法、受体为植物细胞：农杆菌介导法 基因枪法基因枪法 花粉花粉管道法管道法 b.如要如要改良某种生物的性状改良某种生物的性状时，要以改良的生物细胞时，要以改良的生物细胞为受体。为受体。2 2、受体为动物细胞：基因枪法、受体为动
13、物细胞：基因枪法 显微注射法显微注射法 1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 花粉管通道法花粉管通道法 （1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法 特点：特点：易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有感染能力 原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T T-DNADNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程:TiTi质粒质粒 目的基因目的基因 构建构建 表表达达载载体体 导入导入 植植物物细细
14、胞胞 插入插入 植物细胞植物细胞染色染色DNADNA 表达表达 新新性性状状 转入转入 农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法 适用于适用于单子叶植物单子叶植物 （3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是
15、在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基（含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管通道进入受助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。适用于适用于被子植物被子植物 胚珠 花药 花丝 柱头 花柱 子房壁 子房 雄蕊 雌蕊 2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞 （1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提（将基因表达载体提纯，纯，用显微仪注射到用显微仪注射到 受精卵受精卵中）中）（2 2）操作程序）操作程序:提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体 取受
16、精卵取受精卵 显微注射显微注射 移植到子宫移植到子宫 受精卵发育受精卵发育 新性状动物新性状动物 4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞 尽管使用了大量的受体细胞，但真正导入尽管使用了大量的受体细胞，但真正导入了重组了重组DNA分子的受体细胞很少，因此必须将分子的受体细胞很少，因此必须将它从中检测出来。它从中检测出来。筛选的方法主要依赖于筛选的方法主要依赖于质粒中的抗性基因质粒中的抗性基因所表达的产物进行筛选。所表达的产物进行筛选。四环素抗性基因四环素抗性基因（标记基因）（标记基因）四环素四环素培养基培养基 生长被抑制生长被抑制 供体供体DNA 质粒质粒 重组重组DNA 目的基因目的基因 正常生活正常生活 四环素四环素培养基培养基 受体细胞受体细胞 受体细胞受体细胞 问题问题1 1：在受体细胞中检测到含有目的基因，在受体细胞中检测到含有目的基因，能说明转基因成功吗？能说明转基因成功吗？不能。还要看最后该目的基因是否在受体细胞表达。不能。还要看最后该目的基因是否在受体细胞表达。5 5、目的基因的表达、目的基因的表达 问题问题2 2：如何检测？如何检测？检测的方法主