1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数 一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 2 脲酶脲酶 +CO+CO2 2 2NH2NH3 3 +H+H2 2O O 4 4、课题目的、课题目的
2、 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌 一一.研究思路研究思路 .筛选菌株筛选菌株 .统计菌落数目统计菌落数目 .设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链
3、式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株 2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包括包括营养、温度、营养、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止其他微抑制或阻止其他微生物生物生长。也就是用选择性培养基筛选。生长。也就是用选择性培养基筛选。15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2
4、g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基 从用途看此培养基属于哪类？从用途看此培养基属于哪类？从化学成分看此培养基属于哪类？从化学成分看此培养基属于哪类？选择培养基选择培养基 合成培养基合成培养基 15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2
5、g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素 15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2OO 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POP
6、O4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：此培养基是否对微生物具有筛选作用？如果此培养基是否对微生物具有筛选作用？如果有，是如何进行筛选的？有，是如何进行筛选的？有有，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才，此培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择
7、出分解尿素的微生物。6 6、怎、怎样证明此培养基具有选择性呢？样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为 唯一氮源唯一氮源 的培养基的培养基 牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨 培养基培养基 是是 判断该培养基有选择性判断该培养基有选择性 实验组实验组 对照组对照组 培养基类型培养基类型 是否是否 接种接种 结果结果 只生长分解只生长分解尿素细菌尿素细菌 生长多种生长多种微生物微生物 是是 1.1.稀释涂布平板法（稀释涂布平板法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞
8、繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。计算方法：计算方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。.统计菌落数目：统计菌落数目：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数中的细菌数。在对应稀释倍数10106 6的培养基中，得到的培养基中，得到以下
9、两种统计结果。以下两种统计结果。1.1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为计的菌落数为230230。2.2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个，该同学以这三个平板上菌落数的平均值平板上菌落数的平均值163163作为结果。作为结果。你认为哪位同学的结果更接近真实值你认为哪位同学的结果更接近真实值?你认为这你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？分析：分析：答：
10、答：都不接近，都需要改进都不接近，都需要改进。第一位同学需要设置重。第一位同学需要设置重复实验组。第二位同学统计的三个菌落数相差太大，复实验组。第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需要重新实验。说明操作有误，需要重新实验。小结小结 为使结果接近真实值可将同一稀释度的为使结果接近真实值可将同一稀释度的稀释液涂布到稀释液涂布到三个或三个以上三个或三个以上的平板中培的平板中培养。养。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数，计算出菌的平板上进行计数，计算出菌落落平均数平均数 统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际
11、数目低实际数目低。2 2、显微镜直接计数法：、显微镜直接计数法：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点 设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目的是排除实验组中非测非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌
12、的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)如何设计实验证明呢？如何设计实验证明呢？小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照
13、的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土
14、壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行旁进行 三三样品的稀释样品的稀释 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生
15、物采用不同的稀释度 稀释倍数稀释倍数 目的目的 细菌细菌 10104 4、10105 5、10106 6 放线菌放线菌 10103 3、10104 4、10105 5 真菌真菌 10102 2、10103 3、10104 4 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 保证获得菌落数保证获得菌落数在在3030300300之间之间适于计数的平板适于计数的平板 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗选用的
16、稀释范围相同吗？分析：分析：土壤中各类微生物的数量土壤中各类微生物的数量（单位：株单位：株/kg/kg）是不同的是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为好氧及兼性厌氧细菌数约为2 2 185185万万，放线菌数放线菌数约为约为477477万万，霉菌数约为霉菌数约为2323.1 1万万。1 1：为获得不同类型的微生物为获得不同类型的微生物，就需要按不同的就需要按不同的稀释度进行分离稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供同时还应当有针对性地提供选择培养的条件选择培养的条件。.取样涂布取样涂布 实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验