1、植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交 回顾：回顾：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养技术的原理是什么？植物组织培养技术的原理是什么？细胞的全能性细胞的全能性 动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞融合动物细胞融合 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 核移植核移植 动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术 其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础 一、动物细胞培养的应用和概念：一、动物细胞培养的应用和概念：1 1、概念：、概念：动物细动物细胞培养就是从动物胞培养就是从动物有机体中取出相关有机体中取出相关的的组织组织,将它分散将它分散成成单
2、个细胞单个细胞,然后然后,放在适宜的放在适宜的培养基培养基中中,让这些让这些细胞生细胞生长和增殖长和增殖.2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖 动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官 细胞悬浮液细胞悬浮液 10代细胞代细胞 50代细胞代细胞 传代培养传代培养 无限传代无限传代 单个细胞单个细胞 加培养液加培养液 原代培养原代培养 胰蛋白酶胰蛋白酶 剪碎剪碎 细胞株细胞株 细胞系细胞系 遗传物质遗传物质未未改变改变 遗传物质遗传物质已已改变改变 3、过程、过程（1 1）细胞贴壁：）细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层）。要求：培
3、养瓶或培养皿的内表面光（单层）。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。滑、无毒、易于贴附。（2 2）接触抑制：）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。触抑制。动物细胞培养特点动物细胞培养特点：贴壁生长、接触抑制贴壁生长、接触抑制 细胞贴壁过程细胞贴壁过程 培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易于帖附。于帖附。(3)原代培养(primary culture)定义：定义：指将要培养的动物细胞取出后，先用指将要培
4、养的动物细胞取出后，先用胰蛋白酶胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的制成一定浓度的细胞悬液细胞悬液，再将该悬液放入，再将该悬液放入培养瓶中培养瓶中培养。培养。过程：从动物机体中取出组织过程：从动物机体中取出组织 剪碎剪碎 加胰蛋白酶加胰蛋白酶 细胞游离细胞游离 制成细胞悬液制成细胞悬液 将细胞将细胞接种到培养瓶内接种到培养瓶内 培养（培养（1 1-2 2天天换一次培养液）换一次培养液）细胞贴壁生长细胞贴壁生长 长成单长成单层细胞层细胞 定义：定义：当原代培养的当原代培养的细胞生长停止细胞生长停止，这，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用时如果要使细
5、胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶胰蛋白酶等等，使细胞从瓶壁上解离下来，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养这个过程称传代培养 (4)(4)传代培养传代培养 (subculture)(subculture)细胞株：传代细胞一般能传到细胞株：传代细胞一般能传到4040-5050代，代，遗传物质一般不会发生改变遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株（强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系了解即可，老课本体系）细胞系：传代细胞
6、系：传代5050代以后不能再传下去，代以后不能再传下去，部分细胞部分细胞遗传物质发生了改变遗传物质发生了改变，能连续传，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。代，获得不死性，叫细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。细胞悬细胞悬浮液浮液 培养瓶培养瓶中培养中培养 5050代代细胞细胞 无限传无限传代代 原代培养原代培养 传代培养传代培养 细胞株细胞株 细胞系细胞系 知识点小结：各个新名词之间的联系知识点小结：各个新名词之间的联系 多数组织细胞固定在表面
7、多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变遗传物质改变 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等清、微量元素等）3、温度和、温度和PH 温度温度36.5+0.5度，pH7.27.4 4、气体环境、气体环境 O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件 保证细胞顺利保证细胞顺利的生长增殖的生长
8、增殖 离体培养的细胞对离体培养的细胞对微生物和有毒物质微生物和有毒物质没有防御能力没有防御能力 能否用胃蛋白酶能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？代替胰蛋白酶？问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞
9、与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰 蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和 细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PHPH值为值为7.27.2-7.47.4，胰蛋白酶作用的适，胰蛋白酶作用的适宜宜PHPH为为7.27.2-8.48.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜PHPH为为
10、2.2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PHPH为为7.27.2-7.47.4的动物细胞培养中无活性。的动物细胞培养中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？培培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、
11、无机盐）、维主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等成分中有动物血清等 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体育成新的动物个体 问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理：细胞增殖。细胞增殖。问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在1010代代以内，为什么？以内，为什么？1010代以内的细胞代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。遗传
12、物质不改变，保持正常二倍体核型。5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用:1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞 3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 6、植物组织培养和动物细胞培养的比较：、植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目比较项目 植物组织培养植物组织培养 动物细胞培养动物细胞培养 原理
13、原理 细胞的全能性细胞的全能性 细胞增殖细胞增殖 培养基性质培养基性质 固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基 培养基特有成分培养基特有成分 蔗糖蔗糖 植物激素植物激素 葡萄糖葡萄糖 促促-动物血清动物血清 培养结果培养结果 植物体植物体 细胞株、细胞系细胞株、细胞系 培养目的培养目的 快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株 获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白 取材取材 植物幼嫩部分或植物幼嫩部分或花药花药 胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的器官或组织的器官或组织 其他条件其他条件 无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件 无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件 复习回顾复习回顾
14、 1 1、动物细胞培养的过程、特点及原、动物细胞培养的过程、特点及原理？理？2 2、植物组织培养与动物细胞培养的、植物组织培养与动物细胞培养的比较？比较？二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1、定义：定义：动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞的细胞核的细胞核,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母去掉细胞核的卵母细胞中细胞中.使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎,这这个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体.3、分类：分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程
15、度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难 2、原理：原理：动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性 4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖 1.）克隆羊多）克隆羊多利培育过程：利培育过程：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞 白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核 细胞核移植细胞核移植 重组细胞重组细胞 电脉冲刺激电脉冲刺激 早期重组胚胎早期重组胚胎 胚胎移植胚胎移植 另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫 妊娠、出生妊娠、出生 克隆羊多利克隆羊多利 特别注意
16、：特别注意：克隆动物性状克隆动物性状与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？不可能！不可能！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核，一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如而细胞质中的遗传物质（如线粒体线粒体DNADNA）来自于受体卵母）来自于受体卵母细胞细胞.二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。物质有关，还受环境的影响。供体供体 受体受体 代孕代孕 受体受体 取供体细胞取供体细胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞以内的细胞.为什么？为什么？用的是去用的是去核的减数核的减数第二次分第二次分裂中期细裂中期细胞（胞（M中中期）为什期）为什么？么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法：促融方法：电刺激电刺激 胚胎移植至胚胎移植至代孕受体内代孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩 2.）核移植流程）核移植流程 供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛 受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养）1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有含有促使细胞核表促使细胞核表达全能性的物达全能性的物质和营养条件。质和营