1、反刍动物养分需要量动物营养学研究方法及实验技术 饲料的营养价值评定包括 两方面内容：一方面要评定饲料中营养成分含量。另一方面要评定饲料中营养物质的可利用性。一、评定反刍动物饲料营养成分含量的方法 概略养分分析法 范氏纤维分析法 CNCPs法 湿分析法 近红外光谱分析(NIRS)1、概略养分分析法 Weende体系根据化学成分分析将饲料成分分为粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、无氮浸出物和水分6大营养成分。以评定比较饲料的营养价值。尽管此体系是饲料营养价值评定的基础，但仅根据化学成分分析并不能说明反刍动物对饲料的消化利用情况。利用概略养分分析所测得的饲料养分与动物消化吸收养分间存在很大差异。因而
2、不能较好地反映饲料的营养价值。2、范氏纤维分析 Van Soest体系在评定粗饲料营养价值方面较Weende体系有了长足的进步。它在Weende体系分析方法的基础上。对粗纤维和无氮浸出物这两个指标进行了修正和重新划分。不仅给出了饲料中各类粗养分的测定值，而且给出饲料某种具体营养成分的含量。洗涤纤维分析的技术路线和工艺流程 3、CNCPS法 CNCPS法即康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系(Comell net carbohydrate and protein systern)。该体系把饲料的化学分析与植物的细胞成分及反刍动物的消化利用结合起来，测定指标多，反映了动物对饲料利用的情况，使分析结果更有
3、参考价值；操作简单，不需要瘘管动物，易于标准化，便于应用计算机为反刍动物编制饲料配方，可以精确估测动物、饲料、环境条件变化情况下动物对营养物质的需要量及利用。对于生产更有指导价值。此体系将饲料的碳水化合物分为4部分：CA为糖类，在瘤胃中可快速降解；CB1为淀粉，为中速降解部分；CB2是可利用的细胞壁，为缓慢降解部分；CC部分是不可利用的细胞壁。碳水化合物的不可消化纤维为木质素x2.4。将蛋白质分为3部分：非蛋白氮(NPN)、真蛋白质和不可利用蛋白质。这3部分分别被描述为PA(NPN)、PB(真蛋白)和PC(结合蛋白质)。真蛋白质又被进一步分为PB1、PB2和PB3三部分。PA和PB1在缓冲液中
4、可溶解，PB1在瘤胃中可快速降解，PC含有与木质素结合的蛋白质、单宁蛋白质复合物和其他高度抵抗微生物和哺乳类酶类的成分。在酸性洗涤剂中不能被溶解(ADFIP)。在瘤胃中不能被瘤胃细菌降解，在瘤胃后消化道也不能被消化。PB3在中性洗涤剂中不溶解(NDFIP)。但可在酸性洗涤剂中溶解，由于PB3与细胞壁结合在一起，因而在瘤胃中可缓慢降解，其中大部分可逃脱瘤胃降解。缓冲液不溶蛋白质减去中性洗涤不溶粗蛋白，剩余部分为PB2。部分PB2在瘤胃中可被发酵，部分流入后肠道中。4、近红外光谱分析 近红外光谱分析通过分析饲料组织结构的直接方法和从动物排泄物中预测饲粮品质的间接方法检测饲料中的主要指标。例如粗蛋白
5、、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、丹宁酸和矿物质等。来综合评价饲料的营养价值。另外还可以用近红外光谱分析法测定的各种营养素参数或有机物体外消化率来构建饲料能量预测模型。近红外光谱分析优点 将NIRs用于饲料养分分析。不需要对样品进行破坏性处理。具有快速、准确、成本低、无污染、不需化学试剂、无须称量的优点。便于对饲料营养价值进行即时监测，指导反刍动物13粮配制提高饲喂质量。目前已成为分析领域的先导技术。美国牧草和草地协会应用此技术制定了豆科、豆科与禾本科混合干草的质量标准。此项技术为牧草营养价值的快速评定和现场交易奠定了技术基础。该技术已在美国得到普及，在我国尚未得到广泛应用。二、评定饲料营养物质可
6、利用性的方法 评定一种饲料的营养价值最准确、最直观的方法就是动物试验，根据动物消化代谢情况。可以评定该饲料的营养价值。反刍动物饲料营养价值的评定方法主要有活体法、半体内法(尼龙袋法)和体外法。体内法是给动物安装十二指肠和回肠瘘管，分别从十二指肠和回肠瘘管采取食糜样本，测定食糜养分在小肠中的消化率。1、体内法 体内法的优缺点 体内法是直接评定反刍动物瘤胃发酵及饲料营养价值的方法，且测定的结果最接近正常的生理状态，具有可靠性和真实性。体内法测定动物对饲料的采食量、消化率和利用率。并以此评估饲料的营养价值。其优点是能测出饲料在体内的实际降解率。而且除能测定蛋白质降解率外。还可以测定碳水化合物在瘤胃的
7、降解、瘤胃微生物蛋白的合成、瘤胃微生物利用能量和降解氮的效率，这是其他方法所不及的。此方法准确性好，是其它方法的标准，其他评定方法都需用体内法进行校正，但是体内法方法复杂，费时费力，需要一定数量的动物和大量的饲料样品，不便于大规模进行。且由于试验动物个体间差异较大，试验结果可重复性较差。不利于测定方法的标准化。而且体内法测定消化率的影响因素很多：标记物不同测定的结果也不同；日粮的频繁更换对动物来说也是一种应激，此种情况下便不能反映家畜的正常生理状况；内源氮的难于准确估计也是引起误差的重要原因；食糜或粪样的代表性及化学成分不同引起的误差也在所难免。2、半体内法 半体内法又称尼龙袋法。是一种评定饲
8、料在瘤胃内降解速度和程度的方法，在国内外应用的最普遍。因其不需要复杂的分析技术及较少的花费，并能直接为实际生产提供可用的参数，逐渐成为取代体内法的评价反刍动物饲料营养价值的参考方法。原理 该法是将被测饲料放在尼龙袋中，通过测定不同培养期饲料蛋白质或有机物吸水量。然后结合该饲料过瘤胃外流速度。从而计算出蛋白质和有机物的瘤胃降解率。再将一定量经过瘤胃降解的待测饲料残渣装入尼龙袋中，封口后由真胃瘘管将尼龙袋投入消化道，从粪便收集排出的尼龙袋，就可测定待测饲料过瘤养分小肠消化率。优点 在活体内进行，能够比较实际地反映出消化道内环境条件，成本低，简单易行，具有较好的重复性和稳定性，便于推广应用，克服了体
9、内法的缺点。不足 受到实验动物的限制，一次评定的样品有限，一次只能测定少量样本，而且需要至少3头瘘管动物来消除动物间的个体差异导致该方法不适合在实验室进行大量样本的常规分析。而且动物实验中其他的一些因素(如微生物污染等)仍难以解决。3、体外法 体外法与体内法和尼龙袋法相比较，具有操作简便，容易标准化、重复性好等优点，从而得到了较广泛的应用，逐渐成为实验室研究的重点。按照饲料培养液成分的不同，体外法可以分为瘤胃液法、酶解法和粪液法。瘤胃液法 包括两步法和体外产气法 两步法 两步法(又称两阶段培养法)是Tdley和Terry于1963年在一步法的基础上提出的。该法以试管培养瘤胃液和饲料样品模拟瘤胃
10、消化来评定饲料的可消化性。即将饲料在瘤胃液中培养48 h后再用胃蛋白酶(pH大约为2)培养48 h，以模拟真胃和部分小肠的消化过程，培养结束后分离出残渣进行分析。两步法可以在体外模拟瘤胃消化。多应用于评定饲料干物质及有机物在瘤胃的降解率。两步法虽克服了常规试验方法所具有的一系列限制因素。但不能测定饲料的动态消化率，不利于饲料的筛选。另外，由于发酵终产物不能外移与反刍动物瘤胃食糜外排的生理规律不相符，也影响测定结果的稳定性和准确性。体外产气法 法体外产气法是评定反刍动物饲料营养价值的一种非常有效的方法。一次可进行大量样本的测定，与体内法相比，不需要大量的试验动物。并且结果与体内法具有高度相关性，
11、已经越来越多地应用在反刍动物饲料营养研究上。原理 体外产气法是基于饲料样品在体外用瘤胃液发酵所产生气体(CO2和CH4)的比率来估计有机物消化率的快速方法。可以评定反刍动物饲料的干物质降解率和代谢能、评定饲料的营养价值、监测饲料的动态降解特性及饲料间的组合效应。最简单的产气记录设备，即一个针口被密封在标有刻度的注射器，在39的培养箱中进行培养，通过产气推动活塞来观测产气量。随后计算机控制程序的引入，推动了半自动的定点实时记录系统和全自动发酵产气实时记录装置的出现。优点 注射器测定法。因其设备简单、易于操作，适用于少量样本的发酵试验。而全自动实时产气装置，能够获得更详尽的数据记录。利于描绘更准确
12、的产气曲线，并可减少人力，适用于大规模的试验。无论是全自动实时产气装置，还是注射器测定产气量，其原理相同。均为通过给每个发酵瓶配备一个气体记录装置，进行产气记录。不足 作为一种体外模拟技术，试验环境有别于动物实际生理状况(如发酵产物的累积)，同 时各种类型的饲料产气量不同，产气量并不能直接衡量不同种饲料之间的降解程度。酶解法 酶解法是用酶溶液代替瘤胃液对饲料营养价值进行评定的一种体外方法。是用商业生物酶制剂(胃蛋白酶、纤维素酶等)与饲料样品培养以评定饲料有机物或蛋白质的降解率的方法。目前主要有单一胃蛋白酶或单一纤维素酶酶解法和蛋白酶一纤维素酶的复合酶解法。优点 测定环境易于标准化，稳定性高，实
13、验室之间可比性强。能大批量在实验室进行操 作，效率高，成本较低，不必维持实验动物，是有前途的实验室评定方法。不足 由于各国研究者所采用的酶程序不同，致使结果无法比较。酶解法只测定某一时间点的降解率而忽略了动态降解率。而且由于酶的特异性，用单一酶或少数几种酶构成的复合酶很难模拟瘤胃中微生物对蛋白质的复杂消化过程。酶解法对于能量含量较高的饲料，可能优于尼龙袋法，但对于粗饲料测定的重复性很差。如果对粗饲料进行分类估测。则可明显提高酶解法与尼龙袋法的相关。粪液法 粪液法是用人工唾液稀释的牛粪液或羊粪液代替瘤胃液对饲料营养价值进行评定的一种体外法。反刍动物粪便主要成分包括未消化的饲料残渣、瘤胃后消化存活
14、下来的瘤胃微生物、来自大肠微生物、内源消化酶等。其中细菌成分及其残渣占了相当大的部分。未消化的瘤胃微生物和来自大肠的微生物是粪便中微生物的主要来源。因此，瘤胃微生物和粪便微生物在一定程度上具有同源性。这是用粪液代替瘤胃液进行体外消化实验的理论基础。优点 粪液法具有简单、准确、重复性好、可批量测定等优点。是在养殖现场或放牧条件下批量测定干草或其他粗饲料体外消化率最有前途的方法。尤其是不使用瘘管动物就可快速测定饲料消化率。符合动物福利倡导者的要求，因此，这种方法越来越受到西方学者的重视。该方法已被用来评定反刍动物营养价值。不足 有报道认为该方法不适合测定低质粗饲料如作物秸秆。因此，有必要对粪液法适
15、用的范围和方法的标准化做进一步研究。三、反刍动物各种营养需要研究的方法 反刍动物营养需要的研究方法中普遍采用的有梯度饲养试验、消化代谢试验、气体代谢试验、绝食代谢试验、比较屠宰试验、碳氮平衡试验等多种方法。利用试验所测得的数据，借助一些参数，借以估测反刍动物的营养需要量。这些试验方法各有优缺点，但是将饲养试验、消化代谢试验、比较屠宰试验、气体代谢试验和绝食代谢试验相结合，是集各种方法的优点进行综合系统分析的理想方法之一，也是目前应用最广泛的研究方法。1、能量的研究方法 能量需要的研究方法仍以饲养试验、消化代谢试验、气体代谢试验及比较屠宰试验4种方法为主。饲养试验和消化代谢试验 饲养试验和消化代
16、谢试验是国内研究能量需要最常用的方法，主要用于研究不同能量水平日粮对生长发育和消化代谢的影响。具体方法是在饲养试验中期进行消化代谢试验，试验采用全收粪法，每日收集排出的粪和尿供营养成分分析。最后综合考虑生长发育情况和消化代谢情况得出一个推荐的能量水平。气体代谢试验 主要是采用呼吸面具法，是根据测得的代谢产物和氧耗。间接计算出产热，测得的值可与测热室或测热柜测得的值相比。其价格低、操作简单、便携性好，具有重要实用价值。比较屠宰试验方法 比较屠宰法测得的结果代表在屠宰前相当长一段时间内的饲养水平、放牧活动及所遭受自然环境变化影响的综合结果，为实测数据，具有相当的可靠性。2、蛋白质需要的研究方法 反刍动物对饲料蛋白质的需要划分为瘤胃微生物需要和动物本身需要。以小肠蛋白质为核心评价反刍动物的蛋白质需要量和饲料的蛋白质营养价值。小肠蛋白质又称为可代谢蛋白质(MP)，主要包括瘤胃微生物合成的蛋白质(MCP)、瘤胃非降解饲料蛋白质(UDP)和极少量的内源蛋白质(ECP)。小肠蛋白质的测定方法 目前评定小肠蛋白质的方法主要有4种：体内法、半体内法(运动尼龙袋法)、动物模拟法(非反刍动物测定法)和体外法