1、论著文章编号:1007 8738(2014)04 0351 04溶酶体相关膜蛋白 2A shNA 对乳腺癌细胞株紫杉醇耐药的影响韩起，陈莎，杨明珍，张竹君，陈安，胡川闽，李淑慧*(第三军医大学西南医院医学检验系临床生物化学教研室，重庆 400038)收稿日期:2013 08 27;接受日期:2013 11 08基金项目:国家自然科学基金(81272909)作者简介:韩起(1988 )，男，河北迁西人，硕士研究生Tel:023-68753761;E-mail:hanqi688163 com*Corresponding author，李淑慧，E-mail:lisilei009 aliyun com
2、 摘 要 目的制备针对人溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)的 shNA 重组慢病毒，获得稳定低表达 LAMP2A 的 MDA-MB-231乳腺癌细胞株，观察 LAMP2A 分子下调对乳腺癌细胞紫杉醇耐药性的影响。方法通过对 LAMP2A 的 mNA 序列分析，设计了 4 条 shNA，通过基因重组技术构建 pGLV-EGFP-shNA 慢病毒表达质粒，并测序鉴定。将构建的表达质粒和包装质粒共转染人胚肾 HEK293T 细胞包装产生慢病毒，测定病毒滴度。将构建的 shNA 慢病毒表达载体感染人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株后，Western blot 法检测 L
3、AMP2A 表达，验证蛋白表达抑制效果。采用 1 nmol/L、10 nmol/L、100nmol/L 的紫杉醇处理 LAMP2A 低表达乳腺癌细胞株后，用 MTT 法观察 LAMP2A 低表达组和对照组之间增殖效率的差异。结果测序结果显示重组慢病毒质粒构建正确，病毒滴度达 2 108TU/mL。乳腺癌稳定细胞株中 LAMP2A 蛋白表达量显著降低。在10 nmol/L、100 nmol/L 紫杉醇处理后，LAMP2A 低表达乳腺癌细胞株对紫杉醇耐药性明显降低(P 0 05)。结论成功构建了人的 LAMP2A 基因 shNA 慢病毒载体，获得了稳定低表达 LAMP2A 的乳腺癌细胞株，证实 L
4、AMP2A 下调能够降低乳腺癌细胞株对紫杉醇的耐药性。关键词 溶酶体相关膜蛋白 2A;小发夹 NA;慢病毒载体;紫杉醇 中图分类号 Q811 4，392 11，392-33，446 62 文献标志码 AThe effect of LAMP2A shNA on the resistance of breast cancer cells to paclitaxelHAN Qi，CHEN Sha，YANG Mingzhen，ZHANG Zhujun，CHEN An，HU Chuanmin，LI Shuhui*Department of Clinical Biochemistry，Southweste
5、rn Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China AbstractObjectiveTo prepare a recombinant lentiviral carring human lysosome-associated membrane protein type 2A(LAMP2A)gene shNA，establish MDA-MB-231 cell line with a low expression of LAMP2A and observe the change in cellresistanc
6、e to paclitaxel MethodsFour shNAs were designed according to the sequencing analysis of LAMP2A mNAThe pGLV-EGFP-shNA lentiviral vector was established by gene recombination technology and was confirmed by DNAsequencing The lentiviral vector and the packaging vector were used to cotransfect the HEK29
7、3T cells to obtain the lentivirusagainst LAMP2A mNA，and the titer of the virus was determined The constructed shNA lentivirus was applied to infecthuman breast cancer cell line MDA-MB-231，and then the cells were screened with puromycin for two weeks The inhibitiveefficacy of the shNA on the LAMP2A p
8、rotein was determined by Western blotting After the breast cancer cell line with a lowexpression of LAMP2A was treated with three different concentrations of paclitaxel(1，10，100 nmol/L)，MTT assay wasperformed to observe the difference in the proliferation ability between the control group and the lo
9、w LAMP2A expression groupsesultsDNA sequencing revealed that the recombinant lentiviral plasmid was correctly constructed with the virus titer reaching2 108TU/mL The LAMP2A protein expression in the obtained breast cancer cell line dropped drastically After the treatmentwith paclitaxel at 10 and 100
10、 nmol/L respectively，the drug resistance of cells with a low expression of LAMP2A was notablyweaker than that of the control group(P 005)ConclusionThe recombinant shNA lentiviral vector against human LAMP2Agene was successfully constructed，and the breast cancer cell line MDA-MB-231 transfected with
11、it stably expressed a lowlevel of LAMP2A It was proved that the down-regulation of LAMP2A could reduce the resistance of breast cancer cells topaclitaxel Key words LAMP2A;shNA;lentiviral vector;paclitaxel153细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2014，30(4)自噬是指细胞将自身的胞质蛋白和细胞器以形成自噬泡的形式由溶酶体降解，对于清除细胞内衰老损伤的细胞
12、器、聚集的变性蛋白和在饥饿状态下使氨基酸的循环再利用等过程中发挥重要作用1。在酵母和哺乳动物中，根据细胞内底物进入溶酶体腔的方式不同自噬可分为巨自噬(macroautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)和小自噬(microautophagy)3 种方式2。分子伴侣介导细胞自噬只存在于哺乳动物中，由热休克蛋白 70(heat shock proteins 70，HSP70)介导，具有高度选择性3。近年研究发现，CMA 在肿瘤发生发展中起着重要的作用，有望成为新的肿瘤治疗靶点4 5;乳腺癌作为女性常见肿瘤之一，其复发和转移是引起死亡
13、的主要原因。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作为常规的化疗药物，已广泛应用于临床治疗，但是后期患者的耐药性已经越来越受到人们的关注。我们前期发现提高巨自噬活性可以显著增加紫杉醇对乳腺癌细胞的抑制作用，即促进细胞巨自噬能降低乳腺癌紫杉醇耐药细胞株 MDA-MB-231细胞及 MDA-MB-468 细胞对紫杉醇的耐药性6，但关于 CMA 对紫杉醇耐药性的影响未见文献报道。鉴于溶酶体相关膜蛋白 2A(lysosome-associated membrane proteintype 2A，LAMP2A)是已公认的 CMA 途径中的关键信号蛋白和限速蛋白7，本研究拟通过构建 LAMP2A的特异性短
14、发夹 NA(short hairpin NA，shNA)慢病毒干扰载体，以此建立稳定低表达 LAMP2A 的乳腺癌细胞株，初步观察其对紫杉醇耐药性的影响，为进一步探讨乳腺癌对紫杉醇耐药机制的研究奠定实验基础。1材料和方法1 1材料HEK293T 细胞株、大肠杆菌菌株 DH5、慢病毒载体系统均购自上海吉码制药技术有限公司，其中，慢病毒干扰载体为 pGLV-EGFP，慢病毒包装载体为 Helper vector-、Helpervector-和 Helper vector-。MDA-MB-231 细胞由本实验室自己保存。LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen 公司，限制性
15、核酸内切酶 BamH和 Eco、DNA 连接酶均购自 Fermentas公司，BCA 蛋白溶度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，兔抗人 LAMP2A 一抗购自 Abcam 公司、小鼠抗人-actin 一抗购自武汉博士德生物工程有限公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ECL 发光液购自 Millipore 公司。甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液、紫杉醇(paclitaxel，PTX，Taxol)购于西安昊轩生物公司。1 2方法1 2 1慢病毒表达质粒 pGLV-
16、EGFP-shNA 的构建通过GenBank检索出人 LAMP2A 基因的编码序列(NM_0022942)，按照 NA 干扰序列设计原则，通过 Oligo Designer3 0 软件设计针对 LAMP2A 基因的 shNA 的寡核苷酸序列，通过评估后最终获得 4 条候选小分子干扰 NA 序列(表 1)。其中，正义链模板的 5端添加了 GATCC，与 BamH酶切后形成的黏端互补;反义链模板的 5端添加了 AATTC，与 Eco酶切后形成的黏端互补。采用 Eco和 BamH酶切 pGLV-EGFP 质粒使其线性化，将合成的核酸 DNA 单链溶解于退火液中，梯度退火。将退火的双链 shNA 模板连接至线性化的载体pGLV-EGFP后，转化感受态细胞 DH5，挑取阳性克隆送Invitrogen公司进行测序鉴定。表 1设计的 LAMP2A 基因 shNA 寡核苷酸序列名称引物序列(5-3)shNA1正向:GATCCGCAGTGCAGATGACGACAATTCAAGAGATTGTCGTCATCTGCACTGCTTTTTTG反向:AATTCAAAAAAGCAGTGCAGATGACGACAATCT