1、实验实验1.1.大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离 2023/2/25 苍南中学 许允文 2 微生物微生物 病毒病毒 细菌细菌 放线菌放线菌 真菌真菌 原生生物原生生物 原核细胞原核细胞 真核细胞真核细胞 非细胞结构非细胞结构 特点：特点：结构结构简单简单,形体形体微小微小.通常要用通常要用光学显微镜或电子光学显微镜或电子显微镜显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构才能看到，有的甚至没有细胞结构.一、基础知识一、基础知识:1.1.微生物的种类微生物的种类:2023/2/25 苍南中学 许允文 3 关于大肠杆菌关于大肠杆菌:革兰氏染色：革兰氏染色：代谢类型：代谢类型：主要分布：主要分布：危害
2、：危害：应用：应用：革兰氏阴性菌（不着色）革兰氏阴性菌（不着色）异养兼性厌氧型异养兼性厌氧型 肠道肠道 一般无害，少数有害一般无害，少数有害 是基因工程中的主要受体菌之一是基因工程中的主要受体菌之一 2 核糖体核糖体 1 阅读阅读P18-19 2023/2/25 苍南中学 许允文 4 2.2.微生物的培养微生物的培养:1)1)培养基的营养成分培养基的营养成分:2)2)培养基的种类培养基的种类:碳源碳源 氮源氮源 水分水分 无机盐无机盐 生长因子生长因子 按物理性质分按物理性质分 液体培养基液体培养基:扩大培养扩大培养 固体培养基固体培养基:分离、鉴定、纯化分离、鉴定、纯化 按功能分按功能分 普
3、通培养基：普通培养基：选择培养基：筛选选择培养基：筛选 鉴别培养基：鉴定鉴别培养基：鉴定 含氨卞青霉素的培养基含氨卞青霉素的培养基 伊红伊红美蓝培养基美蓝培养基 2023/2/25 苍南中学 许允文 5 3.3.细菌的分离细菌的分离:原理原理:不同的细胞具有不同的菌落特征不同的细胞具有不同的菌落特征;有些微生物对抗生素、高盐等具有抗性的有些微生物对抗生素、高盐等具有抗性的特点。特点。方法方法:划线法、涂布法划线法、涂布法 选择培养基培养选择培养基培养 2023/2/25 苍南中学 许允文 6 二、大肠杆菌的培养与分离二、大肠杆菌的培养与分离 实验目的实验目的:1 1、进行大肠杆菌的、进行大肠杆
4、菌的扩增扩增，利用，利用_培养基培养基进行细菌培养操作。进行细菌培养操作。2 2、进行大肠杆菌的、进行大肠杆菌的分离分离，利用，利用_培养基培养基进行细菌的进行细菌的划线培养划线培养。3 3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。理。液体液体 固体固体 2023/2/25 苍南中学 许允文 7 一、配制培养基，调整一、配制培养基，调整pHpH并灭菌，倒平板备用。并灭菌，倒平板备用。按一定营养比例配制培养基按一定营养比例配制培养基+琼脂，融化琼脂，融化 调整调整pH pH 灭菌灭菌 倒平板、搁斜面倒平板、搁斜面 细菌细菌:中性偏碱中性偏碱 霉菌霉菌:中性偏
5、酸中性偏酸 1、放走冷空气；、放走冷空气；2、灭菌锅压力与大气、灭菌锅压力与大气压相同时才能打开。压相同时才能打开。2023/2/25 苍南中学 许允文 8 倒平板、搁置斜面倒平板、搁置斜面 待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯附近倒平板。左右时，在酒精灯附近倒平板。凝固后，倒置放置凝固后，倒置放置 思考：如何鉴定灭菌思考：如何鉴定灭菌是否彻底？是否彻底？放入培养箱中，放入培养箱中，2d后观后观察平板是否有菌落生成察平板是否有菌落生成 2023/2/25 苍南中学 许允文 9 二、接种、扩大培养二、接种、扩大培养 1、扩大培养所、扩大培养所用的培养基是？用的培养基是？2、接
6、种的场所、接种的场所是？是？3、为何要等接、为何要等接种环冷却后，再种环冷却后，再取菌体？取菌体？2023/2/25 苍南中学 许允文 10 三、划线分离三、划线分离 1、第、第2、3、4级划线前是否都要对接种环进行灭菌？级划线前是否都要对接种环进行灭菌？2、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端？、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端？2023/2/25 苍南中学 许允文 11 2023/2/25 苍南中学 许允文 12 四、培养四、培养 将接种后的培养皿放入恒温箱内，将接种后的培养皿放入恒温箱内，在在3737下倒置培养下倒置培养1212-24h24h。平板稀释涂布法平板稀释涂布法 平
7、板划线法平板划线法 2023/2/25 苍南中学 许允文 13 平板划线分离法平板划线分离法 用途：一般多用于从菌种的纯化；用途：一般多用于从菌种的纯化；优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；缺点：不能计数缺点：不能计数 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。基的回收率计数。优点：可以计数，可以观察菌落特征。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，
8、长不出单好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。菌落。2023/2/25 苍南中学 许允文 14 五、纯化与保存五、纯化与保存 1 1、如何进一步、如何进一步纯化菌种？纯化菌种？2 2、如何保存菌、如何保存菌种？种？2023/2/25 苍南中学 许允文 15 1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板
9、了。烫手时，就可以进行倒平板了。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。微生物污染培养基。2023/2/25 苍南中学 许允文 16 3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿壁的部位，这个平板还能用来培养在皿盖与皿壁的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？微生物吗？为什么？答：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造答：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成菌落的
10、细菌随水而扩散，得不到单细胞菌落；成菌落的细菌随水而扩散，得不到单细胞菌落；防止杂菌污染。防止杂菌污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿壁答：空气中的微生物可能在皿盖与皿壁的培养基上滋生而造成污染，因此最好不要用的培养基上滋生而造成污染，因此最好不要用这个平板培养微生物。这个平板培养微生物。2023/2/25 苍南中学 许允文 17 5.5.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？6.6.在培养后如何判断是否有杂菌污染？在培养后如何判断是否有杂菌污染？7.7.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？操作快捷操作快捷,减少操作时
11、间减少操作时间;灭菌要彻底灭菌要彻底,降低环境降低环境污染几率污染几率;注意微生物生长条件注意微生物生长条件,如如pHpH、渗透压、渗透压、温度等。温度等。是否有不同形态的菌落；用显微镜镜检细胞、孢是否有不同形态的菌落；用显微镜镜检细胞、孢子、芽孢等形态。子、芽孢等形态。高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 2023/2/25 苍南中学 许允文 18 8 8、转基因用的质粒通常加入了如抗氨苄青、转基因用的质粒通常加入了如抗氨苄青霉素基因。转基因质粒转化进入大肠杆菌后，霉素基因。转基因质粒转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其他
12、没有抗氨苄青霉被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌与不能生长。如何分离转基因素基因的杂菌与不能生长。如何分离转基因工程菌，并保证不被普通的大肠杆菌污染？工程菌，并保证不被普通的大肠杆菌污染？将菌种接种在含氨苄青霉素的培养基中将菌种接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。培养。2023/2/25 苍南中学 许允文 19 1 1、高压蒸气灭菌、高压蒸气灭菌 2 2、灼烧灭菌、灼烧灭菌 3 3、紫外线灭菌、紫外线灭菌 4 4、过滤（去除杂菌）、过滤（去除杂菌）思考：灭菌与消毒有何区别？思考：灭菌与消毒有何区别？灭菌的方法：灭菌的方法：消毒：消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。生物的过程。灭菌灭菌:以化学剂或物理方法消灭以化学剂或物理方法消灭所有所有微生物，包括所微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无完全无菌菌之过程。之过程。2023/2/25 苍南中学 许允文 20 菌落菌落单个或少数细菌在固体培养基上单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体具有一定形态结构的子细胞群体。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。