1、大肠菌群计数检验大肠菌群计数检验 大肠菌群是指一群在大肠菌群是指一群在37C培养培养24小时能分解乳糖小时能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。菌。作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义 食品中大肠菌群数系以每食品中大肠菌群数系以每100g（或（或mL）检样内大）检样内大肠菌群最可能数（肠菌群最可能数（the most probablenumber-简简称称MPN）表示。）表示。旧国家标准旧国家标准 第一法第一法 大肠菌群大肠菌群MPN 计数法计数法 第二法第二法 大肠菌群平板计数法大肠菌群平板计
2、数法 第一天 第第1、3、5、7小组：小组：使用第一法（附带做第二法中，使用第一法（附带做第二法中，两个平板接种），以自来水为样品。两个平板接种），以自来水为样品。第第2、4、6小组：小组：使用第二法（附带做第一法中，使用第二法（附带做第一法中，3个试管初发酵试验），以污水为样品。个试管初发酵试验），以污水为样品。第一法：检样稀释与初发酵试验第一法：检样稀释与初发酵试验 MPN：表示食品中大肠菌群数是以每：表示食品中大肠菌群数是以每100ML或克检样内大肠或克检样内大肠菌群最大可能数。一般采用菌群最大可能数。一般采用9管法管法.一般样品一般样品25ML（克）（克）+225ML生理盐水生理盐水=
3、1：10，从，从10-1取样取样1ML，接种到，接种到3管管LST（月桂基硫酸盐胰蛋白（月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤）中。胨肉汤）中。从从10-1取样取样1ML+9 ML生理盐水生理盐水=1：100，从，从10-2取样取样1ML，接种到，接种到3管管LST中。中。从从10-2取样取样1ML+9 ML生理盐水生理盐水=1：1000，从，从10-3取取样样1ML，接种到，接种到3管管LST中。中。第二法：检样稀释与平板计数第二法：检样稀释与平板计数 检样稀释：同上。检样稀释：同上。平板计数：平板计数：1、每个稀释度接种、每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿个无菌平皿，每皿1mL稀稀释样品，另外一个平皿加释
4、样品，另外一个平皿加1mL生理盐水作空生理盐水作空白对照。白对照。2、及时将、及时将1520mLVRBA（结晶紫中性红胆（结晶紫中性红胆盐琼脂）倾注每个平皿中。盐琼脂）倾注每个平皿中。3、待琼脂凝固后，再加、待琼脂凝固后，再加34mLVRBA覆盖表覆盖表层。翻转平板培养。层。翻转平板培养。第二天第二天 第一法第一法 复发酵试验复发酵试验 用接种环从产气的用接种环从产气的LSTLST肉汤管中分别肉汤管中分别取培养物取培养物1 1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLBBGLB）管中，）管中，363611培养培养48h48h2h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳观察产
5、气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。性管。第二法第二法 平板菌落数的选择与证实试验平板菌落数的选择与证实试验 平板菌落数的选择平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在15CFU15CFU150CFU 150CFU 之间的平板，分别计数之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm 0.5mm 或更大。或更大。证实试验证实试验 从从VRBA VRBA 平板上挑取平板上挑取1010个不同类型的典型和可疑菌落，个不同类型的典型和可疑
6、菌落，分别移种于分别移种于BGLB BGLB 肉汤管内，肉汤管内，36 36 1 1 培养培养24 h24 h48 h48 h，观察产气情况。凡，观察产气情况。凡BGLB BGLB 肉汤管产气，即可报肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性告为大肠菌群阳性。（2）原理）原理 溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸产酸的的大肠菌群。大肠菌群。胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。胆盐可以抑制其它
7、细菌生长繁殖。分解乳糖产酸分解乳糖产酸产气产气的大肠菌群，看小倒管中的气体。的大肠菌群，看小倒管中的气体。1 产气 2 不产气 杜氏发酵管产气情况杜氏发酵管产气情况 第四天：大肠菌群计数报告 第一法：第一法：确证大肠菌群确证大肠菌群LST阳性管数，检索阳性管数，检索MPN表（见附录），报告每表（见附录），报告每g（mL）样）样品中大肠菌群的品中大肠菌群的MPN值。值。第二法：第二法：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以结晶经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以结晶紫中性红胆盐琼脂（紫中性红胆盐琼脂（VRBAVRBA）中计数的平板菌落数，）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每再乘以稀释倍数，即为每g g（mLmL）样品中大肠菌群数。）样品中大肠菌群数。例：例：1010-4 4样品稀释液样品稀释液1mL1mL，在，在VRBAVRBA平板上有平板上有100100个典型个典型和可疑菌落，挑取其中和可疑菌落，挑取其中1010个接种个接种BGLBBGLB肉汤管，证实肉汤管，证实有有6 6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1001006/106/1010104 4/g/g（mLmL）=6.0=6.010105 5CFU/gCFU/g（mLmL）。）。