1、EAAL 扩增活化的自体淋巴细胞扩增活化的自体淋巴细胞治疗肿瘤技术简介治疗肿瘤技术简介 Introduction of EAAL Therapy 肿瘤免疫治疗的机制 Mechanisms of Cancer Immunotherapy 通过调动机体自身的免疫系统，达到控制肿瘤生长，杀伤肿瘤细胞的目的。前提：肿瘤细胞有别于正常细胞 肿瘤抗原 肿瘤特异性T细胞免疫应答 肿瘤特异性抗体免疫应答 天然免疫对肿瘤细胞的杀伤作用 如何达到有效的免疫治疗效果 有足够可以识别肿瘤抗原的杀伤性T细胞 机体的免疫环境有利于上述细胞发挥抗肿瘤功能 Th1/Th2 Treg 这些T细胞可以到达肿瘤组织局部 T 细胞归
2、巢 在肿瘤局部，这些T细胞可以发挥有效的杀伤功能 肿瘤基质及肿瘤组织微环境 肿瘤疫苗肿瘤疫苗 过继细胞免疫治疗过继细胞免疫治疗 肿瘤的免疫治疗方法 Approches of Cancer Immunotherapy 细胞免疫治疗 Cellular Immunotherapy 包括肿瘤在内的多种慢性病的最重要的生物治疗方法之一 肿瘤的细胞免疫治疗：非特异性 LAK细胞 CIK细胞 EAAL细胞 特异性 Provenge,树突状细胞 肿瘤特异性T细胞 -其它慢性病的细胞免疫治疗：慢性病毒感染性疾病 乙肝、丙肝 艾滋病 慢性寄生虫感染 糖尿病 多发性硬化症 系统性红斑狼疮 扩增活化的自体淋巴细胞（E
3、AAL）的定义 自体免疫细胞治疗技术 CD3+T淋巴细胞为主（95.91%0.24%），含少量NK细胞 体外扩增活化 肿瘤杀伤功能 改进的LAK和CIK治疗：细胞培养效率和肿瘤杀伤能力显著增强 EAAL是Expanded Activated Autologous Lymphocytes（扩增活化的自体淋巴细胞）的简称。其定义是通过采取机体自身20-100ml静脉血，分离获得0.8-3 x 107外周血单个核细胞，经过体外无血清培养基培养，获得以CD3细胞为主的，包含CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD3+CD56+NKT细胞、NK细胞，细胞数量在3 x 109以上的活化的混合淋巴细胞，
4、这些细胞在体外具有明确肿瘤杀伤功能。EAAL技术特点 使用无血清无血清淋巴细胞培养基进行细胞培养，保证没有潜在的病源微生物感染 不需使用单采机不需使用单采机，对患者免疫系统没有破坏作用 细胞扩增的高效性和高活性高效性和高活性:扩增效率约为2001000倍 独特的细胞培养工艺，少量外周血少量外周血即可满足多次细胞回输的要求 可与化疗联合可与化疗联合，完全满足多个化疗疗程对细胞治疗次数和细胞治疗数目的要求，从而产生较好的协同治疗肿瘤效果。可进行多次、高频治疗多次、高频治疗，达到最好的治疗效果 EAAL技术的临床-实验室操作流程 1616Manufacturing process of Manufa
5、cturing process of ImmunecellImmunecell-LCLC外周血 20-100ml 扩增及活化 回输 100ml/次，1-8次 培养及扩增14-35天 收集诱导的 杀伤细胞 EAAL的作用机制研究 自体肿瘤细胞的体外杀伤效应（IFN-）培养后的淋巴细胞与顺铂以不同序贯方式联合对PLA-801D细胞的抑制率 Group inhibited rates(%)Q DDP EAAL DDP+EAAL 淋巴细胞作用前10h顺铂 淋巴细胞作用前8h顺铂 淋巴细胞作用前4h顺铂 淋巴细胞作用同时顺铂 淋巴细胞作用后4h顺铂 淋巴细胞作用后8h顺铂 淋巴细胞作用后10h顺铂 46
6、1.7 41.73.0 35.81.3 27.12.4 18.51.3 16.72.2 14.00.9 16.60.4 16.60.4 16.60.4 16.60.4 16.60.4 16.60.4 16.60.4 88.10.64*88.90.16*96.71.99*55.80.33*73.60.67*66.20.12*53.20.14*1.602 1.732 2.080 1.424 2.297 2.169 1.885(注：联合作用组、单顺铂组和单淋巴细胞作用组抑制率进行单因素方差分析,P0.01*)xEAL联合化疗的体外杀伤效果 EAL细胞的肿瘤抗原特异性分析 Donor A2-01 A2
7、-02 A2-03 Cancer Antigen NY-ESO-1 BC(%)0.17 0.86 0.32 AC(%)1.12 2.57 2.3 Multiple 6.59 2.99 7.19 MAGE-1 BC(%)0.39 0.07 0.1 AC(%)0.25 1.15 0.51 Multiple 0.64 16.43 5.10 MAGE-3 BC(%)0.45 0.06 0.07 AC(%)0.28 0.36 0.36 Multiple 0.62 6.00 5.14 MAGE-10 BC(%)0.52 0.15 0.23 AC(%)0.25 0.22 0.48 Multiple 0.48
8、 1.47 2.09 P53 BC(%)0.63 1.13 0.78 AC(%)5.27 12.24 8.7 Multiple 8.37 10.83 11.15 HIV BC(%)0.59 0.2 0.22 AC(%)0.24 0.25 0.31 Multiple 0.41 1.25 1.41 FLU BC(%)1.06 0.6 0.66 AC(%)4.44 11.76 10.01 Multiple 4.19 19.60 15.17 EAAL在裸鼠体内 对HepG2形成肿瘤的抑制作用 裸鼠注射裸鼠注射EAALEAAL细胞的剂量分组细胞的剂量分组 组别组别 注射渠道注射渠道 注射注射剂剂量量(细
9、胞数细胞数/只只)注射液量注射液量(ml)每组裸鼠数量每组裸鼠数量(个体号个体号)每组肿瘤每组肿瘤 平均体积（平均体积（mm3）每组肿瘤每组肿瘤 平均重量（平均重量（g）G1 阴性对照组 微静脉 0 0.3 10(1M01 1M10)1444.69 0.96 G2 低剂量组 微静脉 1.7 105 0.3 10(2M11 2M20)1236.45 0.82 G3 中剂量组 微静脉 5 105 0.3 10(3M21 3M30)979.91 0.73 G4 高剂量组 微静脉 15 105 0.3 10(4M31 4M40)941.39 0.72 G5 阳性对照组 腹腔 2 mg/kg 10 ml
10、/kg 10(4M41 4M50)847.92 0.64 p 0.05 G1 G2 G3 G4 G5 EAAL对患者体内免疫环境的改变作用 1.1.CD8+CD8+杀伤性杀伤性T T淋巴细胞比例上升淋巴细胞比例上升 2.2.NKNK细胞比例上升细胞比例上升 3.3.CD4/CD8 TCD4/CD8 T淋巴细胞比值下降淋巴细胞比值下降 4.4.分泌分泌的的IFNIFN-细胞比例上升细胞比例上升 5.5.IFNIFN-的分泌量上升的分泌量上升 经经EAALEAAL治疗后，患者体内杀伤性淋巴细胞数量和比治疗后，患者体内杀伤性淋巴细胞数量和比例显著增加例显著增加 EAAL为CD8+T细胞为主 细胞表面
11、分子细胞表面分子 培养前的百分比培养前的百分比（均值）（均值）培养后的百分比培养后的百分比（均值）（均值）CD3 65.0 83.7 CD4 33.2 10.6 CD8 22.8 63.0 CD4/CD8 1.9 0.2 CD3+CD56+5.4 11.7 CD3-CD16+12.6 11.8 CD4+CD25+3.3 1.7 IL-2 IFN-g g IL-4 IL-5 TNF-a a b b-actin 0 1 5(m mg/ml)PHA IL-2IFNIL-4IL-5TNF0300600900120015001800Ratios to b-actin untreated 1 mg/ml
12、PHA 5 mg/ml PHAA B Figure 5.Cytokine gene expression by ex vivo-expanded T cells.Expanded CyT cells were re-stimulated with PHA(1 and 5 mg/ml)for 4 hr and total RNA was extracted from the cells and the gene expression levels of IL-2,IFN-g,IL-4,IL-5,and TNF-a were analyzed by RT-PCR(A).Band areas wer
13、e analyzed using an image analysis systems(Multi-Analyst,Bio-Rad,CA),and data were presented as ratios vs.b-actin,which served as an internal control(B).Representative image from sample#4 was shown.EAAL细胞分泌Th1类细胞因子 CD3+CD8+PREPOST01020304050P=0.0036PercentageCD3-CD56+PREPOST01020304050P=0.0485Percen
14、tagePRE POST CD4/CD8PREPOST01234567P=0.0333PercentageCD3+CD4+PREPOST05101520253035404550556065P=0.5278PercentageIFN-g g+PREPOST0255075100*P=0.0005PercentageCD3+IFN-+PREPOST0510152025303540455055P=0.0060PercentageCD3-IFN-g g+PREPOST05101520253035404550556065P=0.0145PercentageThe subsets of IFN-gamma+
15、lymphocytes CD3+CD8+IFN-g g+PREPOST0510152025P=0.0269PercentageCD3+CD8-IFN-g g+PREPOST01020304050P=0.0079PercentageThe change of the ratio of IFN-gamma+cells EAAL的疗效 单独使用 手术后预防复发 稳定肿瘤 改善生活质量 与化疗/靶向治疗联合 协同作用 改善化疗和靶向治疗副作用 延长患者的总生存期 術 後 复 发 期間 免疫群（76例）（）対照群（74例）値（）5年以内复发 45(59%)57(77%)0.01 2年以内复发 25(33
16、%)40(54%)0.005（LANCET 2000;356;802-07）EAAL的疗效：降低肝癌手术后的复发率：随机对照临床实验结果 一例晚期肝癌患者实现6年带瘤生存 Hepatology(28),5,1436-7,1998.患者：62岁，男性，丙肝，肝癌Child B级，约7厘米大小。已出现右门静脉肿瘤栓塞和右肾转移（T4N0M1,B期）该肿瘤已无法切除。该患者因此接受了质子照射治疗，治疗后肿瘤出现坏死并且体积缩小至原来的50%。EAAL治疗：放射治疗之后 患者每12月应用一次过继性免疫治疗 平均每次回输细胞1.40.510（10）绝大多数为T细胞标记阳性（95%2%CD3+，902%CD3+/HLA-DR+，61%9%CD8+，39%8%CD4+）且对Daudi细胞具有细胞毒活性的细胞。细胞回输在6年内共为53次完成（平均5-6周一次回输）累计回输细胞总数为7.310（11）结果：获得了6年无复发生存，整个过程没有出现治疗相关的不良反应。在长期观察中，该患者健康状况良好，未出现肝癌的复发，且肝功能好转。左眼睑细胞鳞癌和结肠腺癌双原发（Jpn J Clin Oncol 2000: