1、抗抗GBM病的进展病的进展 1 抗抗GBM病的背景病的背景 抗抗GBM病病是以循环中出现抗是以循环中出现抗GBM抗体及其在抗体及其在脏器中沉积为特征的自身免疫性疾病脏器中沉积为特征的自身免疫性疾病 1919:Goodpasture首先报道首先报道 1例例18岁男性病人，咯血、急性肾衰竭岁男性病人，咯血、急性肾衰竭 1967:Lerner等发现等发现抗抗GBM抗体抗体 1988:Saus等发现等发现 3(IV)NC1为主要靶抗原为主要靶抗原 Goodpasure EM.Am J Med Sci 1919;158:863-870 Lerner RA,et al.J Exp Med 1967;126
2、:989-1013 Saus J,et al.J Biol Chem 1988;15;263:13374-80 2 少见病少见病 本研究所免疫室：本研究所免疫室：累计累计400余例余例 国际上最大的国际上最大的临床资源库临床资源库 我国抗我国抗GBM病的发生情况病的发生情况 3 35 41 50 80 93 124 138 177 188 259 262 306 213 253 318 391 5 12 10 24 27 27 31 30 34 54 44 35 35 49 55 72 0100200300400500ANCAanti-GBM病理学检查病理学检查 光镜：新月体形成光镜：新月体形
3、成 比例高比例高 类型较为一致类型较为一致 荧光：荧光：IgG/C3线样沉积线样沉积 约约50%不典型不典型 肾小球严重肾小球严重受损受损 发生在其他肾小球病基础上发生在其他肾小球病基础上 MN Cui Z,et al.Nephron Clin Pract 2005;99:49-55 Cui Z,et al.Renal Failure 2006;28:7-14 不能依赖肾脏免疫病理确诊不能依赖肾脏免疫病理确诊 4 5 Salant DJ.N Engl J Med 2010;363;4:381-391 6 7 Ea和和Eb：cryptic抗原决定簇抗原决定簇 8 抗抗GBM抗体的检测抗体的检测
4、直接直接免疫荧光法免疫荧光法 肾活检肾活检IgG沿沿GBM线样沉积线样沉积 间接间接免疫荧光法免疫荧光法 正常肾组织正常肾组织IgG沿沿GBM线样沉积线样沉积 ELISA法法-靶抗原靶抗原 人、人、牛牛GBM粗抗原粗抗原 重组重组的人的人 1-5(IV)NC1 免疫印迹法免疫印迹法-靶抗原靶抗原 IIF法要注意暴露隐藏的抗原位点法要注意暴露隐藏的抗原位点 纯化抗原三维立体结构纯化抗原三维立体结构 9 1、ELISA法最为常用法最为常用 2、IIF法和免疫印记法法和免疫印记法 可用于特殊病人的诊断可用于特殊病人的诊断 白白X，未处理，未处理，1：32 白白X，盐酸胍，盐酸胍，1：512 IIF:
5、暴露隐匿的抗原决定簇暴露隐匿的抗原决定簇 10 11 1、血清阴性的抗、血清阴性的抗GBM病？病？近年就诊近年就诊4例患者：例患者：肾活检肾活检 光镜：新月体性肾炎光镜：新月体性肾炎 IF：典型典型IgG线样沉积线样沉积 ELISA 试剂盒：抗试剂盒：抗GBM抗体抗体阴性阴性 Jia XY,et al Nephrology 2012 Feb;17(2):160-6.是否所有抗体都结合到是否所有抗体都结合到GBM上了？上了？血清血清中是否有抗体？中是否有抗体？如何如何监测监测治疗反应？治疗反应？12 IIF经过经过6M盐酸胍处理盐酸胍处理 Patients IIF:titer Native G-
6、HCL GP1 1:32 1:512 GP2 1:32 1:512 P1-1:32 P2-1:32 P3-1:8 P4-1:8 患者血清中存在抗患者血清中存在抗GBM抗体抗体 抗原决定簇抗原决定簇不同不同?Jia XY,et al Nephrology 2012 Feb;17(2):160-6.13 M -N +1 1 2 3 4 +2 患者血清识别患者血清识别 3链上的立体构象链上的立体构象 此类患者血清抗此类患者血清抗GBM抗体识别抗体识别暴露的、高度构象性暴露的、高度构象性的的抗原决定簇抗原决定簇 ELISA包被过程？包被过程？还原还原 煮沸煮沸 非还原非还原 煮沸煮沸 非还原非还原 不
7、煮沸不煮沸 M 1 2 3 4 5 B P1P1：IIFIIF Jia XY,et al Nephrology 2012 Feb;17(2):160-6.14 2、识别线性抗原决定簇的抗、识别线性抗原决定簇的抗GBM抗体抗体 临床上怀疑抗临床上怀疑抗GBM病病 RPGN而依赖透析、少尿而依赖透析、少尿 肾活检主要为细胞新月体：肾活检主要为细胞新月体：IF阴性阴性RPGN-V 常规血清抗常规血清抗GBM抗体抗体阴性阴性 自身抗体阴性的自身抗体阴性的pauci-immune新月体性肾炎：新月体性肾炎：2/13例例 Western blot-还原性条件下：识别还原性条件下：识别线性线性 3(IV)N
8、C1 Unpublished data 检测检测GBM的的线性线性抗原决定簇抗原决定簇 15 N +1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 +M 此类患者主要为此类患者主要为T细胞致病细胞致病?其其B细胞尚未形成针对细胞尚未形成针对GBM构象性抗原位点构象性抗原位点的自身抗体的自身抗体?抗原：抗原：3(IV)NC1 条件：还原，煮沸条件：还原，煮沸 Unpublished data 抗抗GBM病的诊断病的诊断 加用非传统方法增加了检出率加用非传统方法增加了检出率 阐明病生理机制阐明病生理机制 间接免疫荧光法间接免疫荧光法 其他其他ELISA法法 重组的人重组的人 1-5(I
9、V)NC1 免疫印迹法免疫印迹法 立体构象立体构象 线性表位线性表位 既可用于既可用于诊断诊断 也可用也可用于判断疗效和随访于判断疗效和随访 16 临床表型临床表型 Goodpasture病病 肺、肾受累肺、肾受累 肾损害轻重不一肾损害轻重不一 多为多为急进性肾炎急进性肾炎 可为单纯血尿可为单纯血尿 1/3合并合并AMCA 从从正常人到正常人到ESRD？Cui et al.Nephron Clin Pract 2005;99:49-55 17 亲和层析：亲和层析：正常人血清（正常人血清（-）IgG成分成分 Cui Z,et al.Kidney Int 2006:69:894-9 Cui Z,e
10、t al.Kidney Int 2010;78(590-7.偶联偶联 (IV)NC1 正常人正常人IgG成分成分 天然抗天然抗GBM抗体（抗体（0.5%)空柱子空柱子 Natural anti-GBM ab 23/M 间断咯血间断咯血 4 个月，加重个月，加重1个月个月 HGB:71g/l;PO2 58mmHg;Scr 94.0 umol/l 尿常规尿常规:protein(+),RBC 5-8/HPF 血清抗血清抗GBM抗体抗体(+),ANCA(-)肾活检肾活检:IgG沿沿GBM线样沉积线样沉积,肾小球轻微病变肾小球轻微病变 治疗：治疗：Pred 1 mg/kg/d x 8w,无无PE和和CT
11、X 随访随访7年肾功能正常年肾功能正常 Cui Z,et al.Kidney Int 2007;72:1403-8 19 抗抗GBM抗体演变的规律？抗体演变的规律？天然抗天然抗GBM抗体抗体 Anti-GBM(+)严重肾受累严重肾受累 Anti-GBM(+)正常肾功能正常肾功能 正常人正常人 病人病人A 病人病人 C 抗原决定簇抗原决定簇 扩散扩散 3,4 1、2、3、4和和 5 亚型转换亚型转换 IgG2、IgG4 IgG1、IgG2、IgG3和和IgG4 亲和力提升亲和力提升 低亲和力低亲和力 高亲和力高亲和力 治疗个体化治疗个体化 T细胞调控的机理？细胞调控的机理？3 Ea、Eb 3内其
12、他位点内其他位点 21 Anti-GBM(+)轻度肾受累轻度肾受累 病人病人B Cui Z,et al.Kidney Int 2006;69:894-9.Yang R,et al.J Am Soc Nephrol 2007;18(4):1338-43.Cui Z,et al.Kidney Int 2007;72(11):1403-8.Zhao J&Cui Z,et al.Kidney Int.2009;76:1108-15.Cui Z,et al.Kidney Int 2010;78(6):590-7.Chen JL&Hu SY,et al.Clin J Am Soc Nephrol.2013
13、 Jan;8(1):51-8.NATURE REVIEWS|NEPHROLOGY Cui Z,Zhao MH.Nat Rev Nephrol.2011 Dec;7:697-706.病因？病因？抗抗GBM病与其他疾病病与其他疾病 MPO-ANCA阳性小血管炎阳性小血管炎 膜性肾病膜性肾病 Castleman病病 感染？感染？起病前有上感样症状：起病前有上感样症状：20%-60%分子模拟分子模拟 23 抗抗GBM病病因病病因?60%的患者发病前有前驱感染症状的患者发病前有前驱感染症状 是否与病原微生物相关是否与病原微生物相关?分子模拟分子模拟?25 人类抗人类抗GBM病可能发病机制病可能发病机制-
14、分子模拟分子模拟 病原微生物病原微生物 感染感染 交叉反应交叉反应识别人识别人 3(IV)NC1 CD4+T cell/B cell/短肽短肽Ab IF:IgG(+)TB细胞活化细胞活化 识别线性抗原决定簇识别线性抗原决定簇 扩散后识别构象性扩散后识别构象性 DC 递呈线样抗原肽递呈线样抗原肽 T/B细胞识别细胞识别 人人 3(IV)NC1 抗原决定抗原决定 簇扩散簇扩散 抗抗GBM抗体抗体 线性线性 构象性构象性 T/B细胞识别细胞识别 人人 3(IV)NC1 初始线样初始线样 抗原决定簇抗原决定簇 Risk抗原决定簇抗原决定簇 线样线样构象构象 自身免疫自身免疫 性性T细胞细胞 新月体新月
15、体 肾炎肾炎 TCR 识别 MHC/抗原肽复合分子 TCR 抗原肽 MHC T 细胞 抗原递呈细胞 26 基本明确基本明确 正在研究正在研究 DRB1*1501 allele：p=1.597107 DRB1*0404 allele：p=0.037 Patients with DRB1*1501 or*0404 had more crescent formation.(p=0.021).Yang R.et al.Clin Immunol 2009;133:245-250 27 28 寻找起始的抗原决定簇寻找起始的抗原决定簇-病因病因 合成合成24条重叠肽段：条重叠肽段：覆盖覆盖 3(IV)NC1
16、 234个个AA T细胞识别的细胞识别的线性线性抗原决定簇抗原决定簇 B细胞识别的细胞识别的线性线性抗原决定簇抗原决定簇 寻找核心氨基酸序列寻找核心氨基酸序列 分子模拟理论寻找病因分子模拟理论寻找病因 peptide Sequence from N terminal AA position%(n=68)Mean ab levels P1 SPATWTTRGFVFTRHSQTTA 1-20 0-P2 VFTRHSQTTAIPSCPEGTVPL 11-31 1.5%(1)0.10 P3 TAIPSCPEGTVPLYSGFSFLFV 19-40 8.8%(6)0.51 P4 LYSGFSFLFVQGNQRAHGQD 31-50 8.8%(6)0.18 P5 QGNQRAHGQDLGTLGSCLQR 41-60 0-P6 LGTLGSCLQRFTTMPFLFCN 51-70 5.9%(4)0.30 P7 FTTMPFLFCNVNDVCNFASR 61-80 5.9%(4)0.30 P8 VNDVCNFASRNDYSYWLSTPA 71-91 5.9%(4)0.18 P9 NDYSYWLSIPA