1、第二章第二章 细胞工程细胞工程 第二章第二章 细胞工程细胞工程 【知识目标】了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。学习进行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。第三章第三章 细胞工程细胞工程 【技能目标】学会描述植物组织培养、原生质体融合、动物细胞组织培养及细胞融合的基本过程。掌握植物组织培养及快速繁殖的方法。第一节第一节 细胞工程概述细胞工程概述 一、细胞工程的基本概念 细胞工程就是在细胞水平研究、开发和利用各类细胞的工程。细胞工程是一种细胞水
2、平上的遗传工程 第一节第一节 细胞工程概述细胞工程概述 二、细胞工程基础知识 细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。原核细胞如：细菌、放线菌等。真核细胞如：酵母、动植物等。原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA易于人们进行遗传操作，是细胞改造的良好材料。第一节第一节 细胞工程概述细胞工程概述 三、细胞工程基本技术（一）无菌操作技术 实验操作应在无菌室内进行 无菌室要求 注意周围环境的卫生整洁 超净工作台是最基本的实验设备 对生物材料进行彻底的消毒和除菌是实验成功的前提 第一节第一节 细胞工程概述细胞工程概述 三、细胞工程基本技术（二）细胞培养技术 细胞培养是指动
3、物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长 细胞培养步骤为：取材和除菌；配制细胞培养基，并对培养基进行灭菌或除菌；培养室培养 第一节第一节 细胞工程概述细胞工程概述 三、细胞工程基本技术（三）细胞融合技术 1.制备原生质体 2.诱导细胞融合 3.筛选杂合细胞 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 一、植物组织培养（一）预备阶段 1.选择合适的外植体 大小要适宜。同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。植物胚与幼龄组织器官比会化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织。不同物种相同部位的外植体其细胞分化能力可能大不一样。第二节第二节
4、 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 一、植物组织培养 2.外植体的消毒灭菌 外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 一、植物组织培养 3.配制适宜的培养基 组织培养基通常都包括三大类组分：含量丰富的基本成分如蔗糖或葡萄糖高达每升30克，以及氮、磷、钾、镁等；微量的无机物，如：铁、锰、硼酸等；微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 一、植物组织培养（二）诱导去分化阶段 器官切段去分化，培养基中应
5、添加较高浓度的生长素类激素 诱导外植体去分化可以采用固体培养基，在培养室中多层培养 外植体表面除菌后，切成小片（段）插入或贴放培养基表面即可 通常把它们置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 一、植物组织培养（三）继代增殖阶段 愈伤组织长出后经过46周后（四）生根成芽阶段 胚状体 光照是本阶段的必备外因（五）移栽成活阶段 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（一）悬浮细胞培养系统 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定
6、化细胞培养系统 1.平床培养系统 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统 2.立柱培养系统 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统 2.立柱培养系统 要选用高产细胞株系。在营养液中加入目的产物的直接或近直接前体物质，往往对增产目的产物有特效。对各类细胞的培养都应反复摸索碳源、氮源和生长调节物质的配比，找出最佳方案。适量光照及通气在多数情况下有利于产物的生成。第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 二、植物细胞培养和次生代谢物的生
7、产（二）固定化细胞培养系统 以下简要介绍褐藻酸钙固定植物细胞的技术路线：第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 三、植物细胞原生质体制备与融合（一）原生质体的制备 1.取材与除菌 2.酶解 3.分离 4.洗涤 5.鉴定 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合 1.化学法诱导融合 聚乙二醇（PEG）结合高钙高PH诱导融合法 2.物理法诱导融合 平行电极法 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合 融合处理后再生的细胞株将可能的类型：完全的杂合植
8、株核质异源的植株融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分裂生长成嵌合植株。第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 三、植物细胞原生质体制制备与融合（三）杂合体的鉴别与筛选 1.杂合细胞的显微镜鉴别 2.互补法筛选杂合细胞 3.采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 4.根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 四、单倍体植物诱发与利用（一）花药培养 1.选取成熟度适中的花蕾或幼穗 2.花药预处理 3.选择适当的培养基
9、与培养条件（二）花粉培养 培育单倍体植株 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 四、单倍体植物诱发与利用（三）未授粉子房或胚珠的培养 充满希望的发展方向（四）杂交法获单倍体植株（五）单倍体培养物的加倍 可用0.2%0.4%秋水仙素处理2448h 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 五、人工种子的研制（一）人工种子的构成及特点 1.人工种皮 2.人工胚乳 3.胚状体 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 五、人工种子的研制 突出的优点：可以不受环境因素制约有利于保存该种系的优良性状；成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添
10、加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 五、人工种子的研制（二）人工种子的制备 1.胚状体的制备及其同步生长（1）低温法：（2）抑制剂法：（3）分离法：（4）通气法：（5）渗透压法：2.人工胚乳的制备 MS(或SH、White)培养基马铃薯淀粉水解物（1.5%）；SH培养基（12浓度）麦芽糖（1.5%）3.配制包埋剂及包埋 褐藻酸钠 人工种子包埋示意图人工种子包埋示意图 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 五、人工种子的研制（三）人工种子的贮存与萌发 迄今为止尚未攻克的难关。一般将人工种子保存在低温（47）和干燥
11、（相对湿度小于67%）条件下 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 六、植物脱病毒技术（一）植物脱病毒途径 1.物理学方法 2.化学方法 3.生物学方法 基本流程 4.综合脱毒法 第二节第二节 植物细胞工程及其应用植物细胞工程及其应用 六、植物脱病毒技术（二）植物脱毒检测 1.外形观察法 2.电镜观察法 3.免疫血清法 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 一、动物细胞培养 动物细胞工程从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需要，一方面深人探索、改造生物遗传种性，另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞、组织或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利
12、用的动物 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 二、动物细胞组织培养（一）细胞培养法 培养动物细胞一般步骤：无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净。以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。将小组织块置解离液离散细胞（解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子）。低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移至培养瓶培养。第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 二、动物细胞组织培养 1.微导管培养法 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 二、动物细胞组织培养 2.微载体培养法（3）微胶囊培养法 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 二、动物细胞
13、组织培养（二）组织培养法 无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗。以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成12mm2小块，移人培养瓶。加人合适的培养基浸润组织,小心地将培养瓶平翻180，搁置1530min，以利组织块的贴壁生长。翻回培养瓶，平卧静置于37培养。第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 二、动物细胞组织培养（三）培养物的传代（四）无血清培养 三大部分：基础培养基 基质因子生长因子、激素和维生素 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 二、动物细胞组织培养（五）培养物的长期保存 经典传代法 冷冻保存法 液氮保存法为：将成熟培养物（细胞）与510的甘油或二
14、甲亚砜混匀，封装于若干个安瓯瓶中；缓慢降温（每分钟13）至一30；继续降温（每分钟1530min）至一150；转移至液氮冻存,可无限期保存。(六)细胞组织培养污染的防治 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 三、动物细胞融合（一）病毒诱导融合 （二）化学诱导融合 PEG诱导融合（三）电激诱导融合 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 四、单克隆抗体生产技术 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 五、细胞核移植与动物克隆（一）核移植 1.异种核质关系研究 2.脊椎动物克隆细胞核遗传全能性研究 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其
15、应用 五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆“多莉”绵羊是如何克隆诞生的呢？第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆 意义遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物（人）生长、发育、衰老和健康等机理的研究。有利于大量培养品质优良的家畜。经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官。科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆 第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 六、染色体转移（一）微细胞介导法 图 供体细胞秋水仙素处理低温处理细胞破碎高速离心收集染色体 第三节
16、第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 六、染色体转移 直接用微注射针向胞内注射染色体悬液。将染色体与细胞共培养，染色体被细胞以胞吞的方式摄入。本法转移成功率低。将染色体与高浓度CaCl2混匀后滴加到受体细胞上，可提高成功率。用卵磷脂与胆固醇混合液制成脂质体，将染色体包裹其中，再经聚乙二醇与受体细胞融合，达到转移染色体的目的。第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 七、干细胞研究 干细胞（stem cell）是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 七、干细胞研究 三种类型：全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞多能性干细胞，发育潜能受到一定的限制。如：骨髓造血干细胞可分化成为至少12种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞和肌肉中的成肌细胞等。第三节第三节 动物细胞工程及其应用动物细胞工程及其应用 七、干细胞研究