1、植物花药培养及单倍体植株鉴定 20学时 安徽农业大学生命科学学院 高俊山 花药培养：是指将未成熟的花药接种是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。在人工培养基上分化成为植株的过程。属于器官培养。属于器官培养。供体植株供体植株小孢子（小孢子（n）花培花培 花粉植株花粉植株（n）雄核发育雄核发育 自然加倍自然加倍 人工加倍人工加倍 纯合植株纯合植株DH（2n）一年内获得纯系一年内获得纯系 常规育种需常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。一、实验目的与原理一、实验目的与原理 原理原理：利用组织培养技术对利用组织培养技术对植物植物花药进行离
2、体花药进行离体培养，诱导产生培养，诱导产生再生再生植株。植株。通过形态观察通过形态观察和染色体分析鉴定和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的单倍体植株，作为新的遗传资源和选择材料。遗传资源和选择材料。目的：目的：掌握植物花药离体培养技术；掌握植物花药离体培养技术；掌握单倍体植株鉴定的方法；掌握单倍体植株鉴定的方法；了解单倍体育种的意义。了解单倍体育种的意义。花药培养基本流程：花药培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具有胚性小孢子的花药收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚
3、状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株 选择合适的供体植株选择合适的供体植株 单倍体植株鉴定单倍体植株鉴定 二二、实验内容、实验内容 1 1、镜检花粉发育时期、镜检花粉发育时期 2 2、花药离体培养、花药离体培养 2.1 2.1 取样取样 2.2 2.2 消毒消毒 2.3 2.3 接种接种 2.4 2.4 培养培养 3 3、单倍体植株的鉴定、单倍体植株的鉴定 三、实验器材三、实验器材 材料：烟草花药。材料：烟草花药。试剂：试剂：MSMS培养基、培养基、N6N6培养基、培养基、B5B5培养基、培养基、酒精、酒精、2,42,4-D D、NAANA
4、A、KTKT、蔗糖、醋酸洋红、蔗糖、醋酸洋红、蒸馏水。蒸馏水。仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、通光学显微镜、微波炉、pHpH计、培养箱、计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。橡皮筋、低温冰箱。四、实验步骤四、实验步骤 1.1.适期花药的选择适期花药的选择 花药中的花粉是由生殖细胞花药中的花粉是由生殖细胞（体细胞）经过减数分裂而来，（体细胞）经过减数分裂而来，其染色体只是体细胞中的一半，其染色体只是体
5、细胞中的一半，如果通过一定的途径将花粉培如果通过一定的途径将花粉培养成植株，获得单倍体植株。养成植株，获得单倍体植株。再经过染色体加倍，得到纯合再经过染色体加倍，得到纯合的二倍体，大大缩短育种进程。的二倍体，大大缩短育种进程。一般而言，单核期（第一次有丝一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。最佳培养期。形成双核后，在合适的条件下，形成双核后，在合适的条件下，主要由营养细胞分裂产生胚状体主要由营养细胞分裂产生胚状体。花粉发育时期：花粉发育时期：被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（
6、小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）二核期和三核期（雄配子期）4 4个时期。个时期。四分体时期四分体时期 单核靠边期单核靠边期 花药切片显微观察花药切片显微观察 花粉的发育花粉的发育 营养细胞营养细胞 生殖细胞生殖细胞 精子精子 四分体四分体:醋酸洋红染色醋酸洋红染色 四分体四分体:Alexanders 染色染色 单核期单核期 双核期双核期 成熟花粉粒成熟花粉粒 烟草花粉发育时期的检测：烟草花粉发育时期的检测：一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1 1-2 2滴滴1%1%醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育
7、时期。单核晚期单核晚期 液泡液泡 第一次有丝分裂后期第一次有丝分裂后期 双核早期双核早期 双核中期双核中期 生殖核生殖核 生殖核生殖核 营养核营养核 处于不同发育阶段的烟草花芽处于不同发育阶段的烟草花芽 烟草花粉发育时期的确定 烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。从烟草花的外部形态变化来看，从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼的长当花蕾的花冠长度与花萼的长度相等度相等时，花药里面的多数花时，花药里面的多数花粉粒正处于单核靠边的阶段。粉粒正处于单核靠边的阶段。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期不同物种诱导胚胎发生
8、的最佳小孢子发育时期 发育时期发育时期 物种物种 减数分裂期减数分裂期 草莓、番茄草莓、番茄 四分孢子期四分孢子期 葡萄葡萄 单核早中期单核早中期 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 单核晚期单核晚期 荔枝、茄子、青椒、小麦荔枝、茄子、青椒、小麦 单核早期至晚期单核早期至晚期 烟草烟草 单核早期至双核期单核早期至双核期 梨、水稻、甘蓝梨、水稻、甘蓝 四分孢子期至双核期四分孢子期至双核期 玉米玉米 2.2.花药离体培养花药离体培养 （1 1）取材）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状
9、态）宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态）（2 2）消毒）消毒 70酒精擦洗花蕾表面，酒精擦洗花蕾表面，70酒精浸泡酒精浸泡15-30s后，在后，在1次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在或在0.1的的氯化汞溶液中消毒氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-5次。次。（3 3）接种）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，但不应使花药受到损伤。但不应使花药受到损伤。（4 4）培养）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（成胚或愈伤，并突
10、破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。花药培养过程 取花蕾（镜检）取花蕾（镜检）预预处理处理 取花药取花药 消毒消毒 接种接种 培养培养 愈伤组织发生愈伤组织发生 预处理预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。预处理是小孢子培养成功的前提条件。预处理目的：预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量
11、大量增加。能使绿苗产量大量增加。预处理方法：预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。烟草花药培养，烟草花药培养，44低温低温预处理预处理2 2-3 3天。天。培养基培养基 主要为主要为MS、H、N6、B5和和Nitsch培养基，在此培养基，在此基础上发展出一些其它的培养基。基础上发展出一些其它的培养基。H H培养基（基本成分培养基（基本成分+6 6-BA/KT 2mg/L+NAA/2,42mg/L+NAA/2,4-D D 0.2mg/L0.2mg/L+30g/L+30g/L蔗糖蔗
12、糖+7g/L7g/L琼脂琼脂+1g/L+1g/L活性炭，活性炭，pHpH值值5.55.5-5.85.8）上）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到H H培培养基（养基（基本成分基本成分+NAA 2mg/NAA 2mg/L L+6+6-BA 0.2mg/0.2mg/L L+20g/L+20g/L蔗糖蔗糖+7g/L7g/L琼脂琼脂）上分化成苗。）上分化成苗。1/2 MS1/2 MS培养基培养基+激素激素+蔗糖蔗糖+琼脂琼脂+活性炭活性炭 高浓度的高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。显著抑制花粉愈伤组织形成。铁盐铁盐对花粉胚状体发育很重要。对花粉胚状体发育很重要
13、。活性炭活性炭促进胚状体发育促进胚状体发育。较高浓度蔗糖较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。可使愈伤组织分化成苗。细胞分裂素细胞分裂素可促进胚状体形成；可促进胚状体形成；生长素生长素可诱导愈伤组织形成。可诱导愈伤组织形成。细胞分裂素与生长素比值高细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。时可诱导愈伤组织分化苗。氨基酸氨基酸 有机附加物有机附加物 类别 化合物 培养基浓度(mg/L)母液扩大倍数 500mL 母 液中药品量(g)每升培养基取母液的量(ml)大 量 元 素 KNO3 950 20倍 9.5 50 NH4NO
14、3 720 7.2 MgSO4 7H2O 185 1.85 CaCl2 2H2O 166 1.66 KH2 PO4 68 0.68 微 量 元 素 MnSO4 4H2O 25 200倍 2.5 5 ZnSO4 7H2O 10 1.0 H3BO3 10 1.0 Na2MoO4 2H2O 0.25 0.025 CuSO4 5H2O 0.025 0.0025 铁 盐 Na2 EDTA 37.3 200倍 3.73 5 FeSO4 7H2O 27.8 2.78 有 机 物 盐酸硫胺素(B1)0.5 200倍 0.05 5 盐酸吡哆素(B6)0.5 0.05 甘氨酸 2 0.2 叶酸 0.5 0.05
15、烟酸 5 0.5 生物素(维生素H)0.05 0.005 肌醇 H培养基的配制培养基的配制 类别 化合物 培养基浓度(mg/L)母液扩大倍数 500mL 母 液中药品量(g)每升培养基取母液的量(ml)大 量 元 素 KNO3 1900 20倍 19 50 NH4NO3 1650 16.5 MgSO4 7H2O 370 3.7 CaCl2 2H2O 440 4.4 KH2 PO4 170 1.7 微 量 元 素 MnSO4 4H2O 22.3 200倍 2.23 5 ZnSO4 7H2O 8.6 0.86 H3BO3 6.2 0.62 KI 0.83 0.083 Na2MoO4 2H2O 0.
16、25 0.025 CuSO4 5H2O 0.025 0.0025 CoCl2.6H2O 0.025 0.0025 铁 盐 Na2 EDTA 37.3 200倍 3.73 5 FeSO4 7H2O 27.8 2.78 有 机 物 盐酸硫胺素(B1)0.4 200倍 0.04 5 盐酸吡哆素(B6)0.5 0.05 甘氨酸 2 0.2 烟酸 0.5 0.05 肌醇 MS培养基的配制培养基的配制 激素激素 名称名称 浓度浓度（mg/mL）100mL母液中母液中药品量（药品量（g）配方配方 NAA 10 1 先少量先少量95%乙乙醇醇或或1 1当量的当量的NaOHNaOH溶溶解解，后加水定容后加水定容 6-BA 10 1 先少量浓先少量浓HCl或或1 1当量的盐酸当量的盐酸溶溶解解，后加水定容后加水定容 2,4-D 10 1 先少量先少量95%95%乙醇或乙醇或1 1当量的当量的NaOHNaOH溶解，溶解，后加水定容后加水定容 KT 10 1 先少量浓先少量浓HClHCl或或1 1当量的盐酸当量的盐酸溶解，溶解，后加水定容后加水定容 培养条件培养条件 1 1、温度、温度 适宜温度是适宜温度是2