1、 Partec-Excellence in Flow Cytometry Contributions to New Developments in Medical Diagnosis and Microbiology 德国德国 Partec公司中国服务中心公司中国服务中心 张向阳张向阳 超过41年的研发经验 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理 流式细胞仪使用一般方法及技巧流式细胞仪使用一般方法及技巧 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 流式细胞术
2、流式细胞术 流式细胞分析，又称流式细胞术（flow cytometry，FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 流式细胞术流式细胞术 流式细胞分析，又称流式细胞术（flow cytometry，FCM），是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素
3、染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 特点：特点：（1 1）单细胞分析。）单细胞分析。（2 2）快速分析。）快速分析。（3 3）多参数相关测量。）多参数相关测量。（4 4）定性或定量分析细胞。）定性或定量分析细胞。（5 5）统计学意义明显。）统计学意义明显。（6 6）分选。）分选。Partec-
4、Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 荧荧 光光 有些物质，当用光照射时，它吸收了该种波长的光后还会发射出各种颜色和不同强度的光，而当光停止照射后，这种发射的光也随之消失，这种发射的光称为荧光(fluorescence)。荧光的波长比吸收光线的波长要长些。由于物质的分子结构不同，所吸收的光和所发射的荧光波长也不同。被这些物质吸收的光称为激发光，产生的发射光即荧光。荧光的颜色多为红、蓝、绿或黄等。物质的荧光有两种，一种是自发性荧光，即组织在短波长光照射下自行发射出的荧光。如，组织中的蛋白质和脂类在紫外线照射下能发射出微弱的淡蓝色荧光。另一种荧光是诱发荧光
5、，即细胞与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧光。常用的是诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称为荧光染料(或称荧光色素)。Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 荧光激发与发射原理荧光激发与发射原理 能量级能量级 激发激发 激发态激发态 发射发射 激光激光 能量损失能量损失 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测细胞表面或细
6、胞内的相应抗原(或抗体)。从而使形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用流式细胞仪检测标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(如，黄、绿色或红色等)，通过确定抗原或抗体的性质、定位来推断细胞的信息，以及利用定量技术测定含量。常用方法：单抗直接标记 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 嵌入性染料嵌入性染料 如DAPI、赫斯特、PI等，直接与细胞内的DNA双螺旋结构中的A-T碱基对结合，从而使细胞在激发光的照射下发特定波长的光，通过判断发射光的强弱来推算A-T碱基对的多少，从而得知DNA的倍性关系。Partec-Excellen
7、ce in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 细胞膜电位、离子、脂类探针细胞膜电位、离子、脂类探针 现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些意想不到的效果。详细信息，见细胞探针公司网站：www.molecularP Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 与流式细胞仪相关的荧光术语与流式细胞仪相关的荧光术语 MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，
8、用来衡量荧光强度 自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为6501150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低 流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在600MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：200MESF以内 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 常见荧光染料列表常见荧光染料列表 染料名称 激发波长（nm）最大发射 波长(nm)应用 抗抗 体体 FITC 488 530 一般应用 PEARDI 488/565 575 FITC及2重染色 ECD 488/565 613 多重免疫染色用 PC5/
9、PE-Cy5 488/565/650 670 多重免疫染色用 PC7/PE-Cy7 488/565 767 多重免疫染色用 Cy5 633 670 多重免疫染色用 APC 650 660 多重免疫染色用 D N A/R N A Pl 488/536 617 1色染色体、DNA细胞周期、除去死细胞 YOYO-l 491 509 DNA细胞周期、除去死细胞 CPO 488 530/670 DNA(530)/RNA(670)、网织红细胞检测 7-AAD 546 647 G-C特异性、DNA细胞周期、除去死细胞 SYTO16 488 518 活细胞染色 SYTOX Green 504 523 DNA细
10、胞周期 TO-PRO-3 642 661 除去死细胞 DAPI 360 DNA细胞周期 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 常见荧光染料列表常见荧光染料列表 钙钙 Fluo-3AAMA 506 525 细胞内钙离子的检测 Fura RedAAMA 473 670 细胞内钙离子的检测 pH BCECF(AM)488 535 细胞内pH SNARF-l(AM)488 587A635 细胞内pH(pH6-9)酶酶 Fluorecein 495 519 与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性 Rhodamine-110 497 520 与酶基质
11、结合后使用、检测活细胞内酶活性 其其 它它 CMFDA 488 530 活细胞内水平检测、MDR Rhodamine-123 488 530 活细胞内线粒体、MDR EGFP 488 510 基因表达 DiOC2(3)488 530 细胞膜电位 DiBAC4(3)493 516 细胞膜电位 DCFH-DA 488 530 细胞内活性酶 DHR 505 534 细胞内活性酶 FDA 488 530 活细胞染色 Calcein AM 496 517 活细胞染色、乙啡叮 同型二聚体-1的双色检测判断细胞死活 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验
12、 常用荧光染料种类常用荧光染料种类 488nm蓝色激光激发：FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PE-Cy5（PE的衍生物）：红色 665nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 637nm红色激光激发：APC(别藻兰蛋白）：红色 665nm APC-Cy5(别藻兰蛋白的衍生物）：深红色 710nm 365nm紫外光激发：DAPI（4，6-咪基-2联苯吲哚）：蓝色 455nm 532nm绿色激光激发：PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PE-Dy647（PE的衍生物）：红色 647nm P
13、E-Cy5（PE的衍生物）：红色 665nm Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 流式细胞仪的原理概述流式细胞仪的原理概述 流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一种自动分析细胞的高端技术设备，其原理是悬浮在液体中的细胞一个个地依次通过测量区，当每个细胞通过测量区并被激发光照射时产生光信号，然后被光电倍增管（PMT）转化成电信号，这些信号可以代表荧光、普通光散射、光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示，于是细胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地测定。上述特征可以是细胞的大小、活性，核酸的数
14、量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。废液废液 检测器检测器&计数器计数器 样品样品 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 流式细胞仪的原理工作原理流式细胞仪的原理工作原理 待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置光学系统（透镜、光阑，滤片和检测器等）用以
15、收集荧光信号。光电倍增管将收集的光信号转化为电信号再传输至计算机，计算机通过相应的软件将电信号模拟成图像。流动室(Flow Cuvette或 Flow Cell)是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为350250um的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢,因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动的液体，操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，使
16、样品流不会脱离液流的轴线方向，结合样品喷嘴的特殊结构，从而保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞信息（散射光和荧光）。超过41年的研发经验 激光，激光，如：如：488nm FL2 PE SSC FSC 液路液路 电子元件部分电子元件部分 计算机计算机 FL3 PerCP,Cy5 FL1 FITC 光学接收器光学接收器 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造 1.流动室及液流驱动系统 2.激光光源及光束形成系统 3.光学系统（滤光片组）4.信号检测与存储系统 5.显示、分析系统 Partec-Excellence in Flow Cytometry 超过41年的研发经验 激激 光光 提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此要求细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何