1、流式细胞术原理流式细胞术原理/用途用途/制样要制样要求求 张波（药理室）15009931220 bozhang_ 流式细胞仪是什么仪器，什么时候会用到？2009年 1月20日 1月23日 2月2日 流式细胞术 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,简称简称FCM）是一）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球
2、等生物、及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量加以定量 BD FACSCalibur 流式细胞仪可检测到的细胞参数 非荧光信号非荧光信号 颗粒度颗粒度 细胞大小细胞大小=前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性相对复杂性 血液涂片血液涂片 外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 Review Question Dead cells are known t
3、o be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells.Which of the populations on this plot would you expect to be dead?流式细胞仪可检测到的细胞参数 荧光信号荧光信号 R1File:4Acquisition Date:06-Mar-03QuadEvents%Gated X MeanY MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.41LR397537.55418.
4、809.87图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死 Two-Color Cell Analysis Which of the three populations has the most Ab A binding sites?Ab A Ab B 样本处理 细胞悬液的制备 细胞悬液：细胞悬液：分离分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小便，样本用血量小 灌洗液、体
5、腔积液灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系 实体组织：实体组织：病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本 鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质（鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质（.22滤膜）滤膜）植物样本的制作 步骤一：选择合适的荧光染料 必须被流式细胞仪上所配备激光器所激发 激发光谱在仪器上滤光片能够接受范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 Optics Laser Fluorochrome Detector Parameter Filter FITC GFP FL1 530/30 PE PI FL2 585/42 PerCP P
6、erCP-CY5.5 FL3 670LP APC FL4 661/16 488 nm 635 nm 步骤二：染色 体积 温度 孵育时间 对照 步骤三：数据收集和分析 画图 寻找目标细胞 调整仪器设置到合适的状态 我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？散点图 密度图 二维等高图 直方图 图 报告中常见的几种流式细胞图 仪器设置调节仪器设置调节 1.用未染色细胞用未染色细胞 调整仪器调整仪器PMT电压电压 开机需准备试剂 建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品（1）Negative Control（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）（3）CD19-PE（FL2 单染）（4）CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2 双染）。2.用单染色的细胞调节仪器补偿用单染色的细胞调节仪器补偿 关于同型对照 例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE 那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照：FITC:细胞加上Ab A FITC,IgG1 PE PE:细胞加上Ab B PE,IgG1 FITC 数据分析数据分析 设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数