1、细菌耐药机制研究进展细菌耐药机制研究进展 浙江大学医学院附属第一医院浙江大学医学院附属第一医院 俞云松俞云松 Antibiotic interactions with gram negative organismsAntibiotic interactions with gram negative organismspenicillin binding proteinspenicillin binding proteinsOmpFOmpFOmpCOmpC CephalosporinsCephalosporins slower diffusion due toslower diffusion d
2、ue tobulk and ionic chargesbulk and ionic charges ImipenemImipenem Rapid diffusion due to small sizeRapid diffusion due to small sizeand zwitterionic and zwitterionic+/-charge)+/-charge)PBP3PBP3PBP2PBP2PBP1aPBP1aPB1bPB1bBeta Lactamases(hydrolyzing enzymes)CBD/RR一、外膜孔蛋白减少或丢失一、外膜孔蛋白减少或丢失 细胞内抗生素浓度降低细胞内
3、抗生素浓度降低 膜孔蛋白膜孔蛋白(OprD):细胞外膜上的细胞外膜上的某些特殊蛋白是某些特殊蛋白是一种非特异性的、一种非特异性的、跨越细胞膜的水跨越细胞膜的水溶性物质扩散通溶性物质扩散通道。道。膜膜 孔孔 蛋蛋 白白 革革 兰兰 阴阴 性性 细细 菌菌 细细 胞胞 膜膜 某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药”“内在性耐药”或“固有性耐药”（或“固有性耐药”（intrinsically resistant），），即这种耐即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或
4、是耐药质粒的获得所药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。致。如如铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。“先天不足”“先天不足”一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋
5、白通道关闭或消失道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。亚胺培南是一种非典型的亚胺培南是一种非典型的-内酰胺类抗菌药物，主要是通内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。“后天获得”“后天获得”产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株 亚胺培南敏感及耐药的亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌产气肠杆菌PFGE图图 C1 C2:亚胺培南
6、敏感亚胺培南敏感 C3 C4:亚胺培南耐药亚胺培南耐药 亚胺培南敏感及耐药亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌的产气肠杆菌SDS图图 C1 C2:亚胺培南敏感亚胺培南敏感 C3 C4:亚胺培南耐药亚胺培南耐药 PCR扩增扩增Omp36全长及序列分析全长及序列分析 IS903 98%（约（约1000bp)插入序列引起插入序列引起OprD2缺失（铜绿）缺失（铜绿）ISPa1328 约约2000bp OprD2 细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性之前失去活性 细菌产生的灭活
7、酶主要有：细菌产生的灭活酶主要有：-内酰胺酶内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶氨基糖苷类钝化酶 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 MLS钝化酶钝化酶 二、二、产生灭活酶产生灭活酶 超广谱超广谱-内酰胺酶（内酰胺酶（ESBLsESBLs）高产高产AmpCAmpC酶酶 碳青霉烯酶碳青霉烯酶 最主要的耐药因素最主要的耐药因素 对对-内酰胺抗生素造成威胁内酰胺抗生素造成威胁 -内酰胺酶内酰胺酶 临床上最重要的临床上最重要的-内酰胺酶内酰胺酶 是是质粒质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基基-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素
8、，并可被克拉维酸等克拉维酸等-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类内酰胺酶抑制剂所抑制的一类-内酰胺内酰胺酶。酶。ESBLs在分子生物学分类中属于在分子生物学分类中属于A类酶，在类酶，在Bush分类分类中属于中属于2be类酶。类酶。超广谱超广谱-内酰胺酶内酰胺酶（extended-spectrum -lactamases，ESBLs）ESBLs的分类 根据基因同源性不同分为：根据基因同源性不同分为：TEM型型 80 SHV型型 46 CTX-M型型 37 OXA型型 18 其它型其它型 20 http:/www.lahey.org/studies/webt.htm.CTX-M-1组组 CTX-M-2组组
9、 CTX-M-8组组 CTX-M-9组组 北京北京浙江浙江新疆新疆郑州郑州基因型基因型EC KPECKP EC KP EC KP合合计计CTX-M-14237763295372209CTX-M-3161661385257CTX-M-245598229CTX-M-22268CTX-M-933CTX-M-281113CTX-M-1311CTX-M-2711CTX-M-2911SHV-12311510SHV-51214SHV-222CTX-M-14+CTX-M-224134416CTX-M-14+CTX-M-322CTX-M-14+SHV-12134CTX-M-3+SHV-1211CTX-M-9+S
10、HV-1211CTX-M-22+SHV-1211CTX-M-24+SHV-1211CTX-M-14+CTX-M-22+SHV-1211CTX-M-14+CTX-M-22+SHV-1211未检出未检出 ESBLs 基因型基因型7814689144合计合计5543109614226586400中国中国400400株株大肠大肠埃希埃希菌和菌和肺炎肺炎克雷克雷伯菌伯菌的基的基因型因型分布分布 32家医院家医院 1994-2003年年 大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率百分率 0102030405060701994199519961998199920002001200220
11、032004年份年份百分比百分比大肠杆菌大肠杆菌肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌头孢菌素酶头孢菌素酶 大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的生染色体介导的AmpC酶。酶。阴沟肠杆菌阴沟肠杆菌 ACT-1,DHA-1,CMY (Peking)DHA-1,CIT,ACT-1 (Shanghai)DHA-1 (Zhejiang)DHA-1,ACT-1(GuangZhou)DHA-1 is The Predominant Type in C
12、hina Map of China 克隆片段克隆片段 PCR产物产物1100bp 共共6432bp ORF1 ORF2 ORF3 ORF4 ORF5 ORF6 IS26 orf-1 DHA-1 ampR qacE1 sul1 5232 bp 指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类霉烯类抗生素的一类内酰胺酶内酰胺酶 分别属于分别属于Ambler分子分类中的分子分类中的A类、类、B类、类、D类类酶酶。碳青霉烯酶碳青霉烯酶 天然来源碳青霉烯酶天然来源碳青霉烯酶 嗜麦芽寡养单胞菌的嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶酶 获得性碳青霉烯酶（获得性碳青霉烯酶
13、（Ambler分子分类）分子分类）B类酶（金属酶）：类酶（金属酶）：IMP、VIM类及类及SPM-1 A类酶：类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等等 D类酶：类酶：OXA-23至至OXA-27、40、48、54 碳青霉烯酶按其来源可分为碳青霉烯酶按其来源可分为 金属酶金属酶 染色体编码的金属酶：染色体编码的金属酶：BC，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。大多来源于环境寄生菌。获得性金属酶：获得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于位于可转移的基因元件可转移的基因元件上，造成区域性传播。上，造成区域性传播。IMP型金属酶型金
14、属酶 IMPIMP型金属酶型金属酶GenBankGenBank上已公布上已公布2121种，比较它们相互之种，比较它们相互之间的序列表明：间的序列表明：IMPIMP型金属酶大致可以分为两组：型金属酶大致可以分为两组：1 1）IMPIMP-1 1、IMP3IMP3-7 7、IMP9IMP91111、IMPIMP-1616 2 2）IMPIMP-2 2和和IMPIMP-8 8、1212、1313、1919、20 20 中国中国 IMP-4 2001年香港年香港 鲍曼鲍曼 2001年广州年广州 杨格枸橼酸杆菌杨格枸橼酸杆菌、铜绿、铜绿 IMP-1 2004年年12月月 江苏无锡江苏无锡 铜绿铜绿 IM
15、P-8 2001 台湾台湾 铜绿铜绿 VIM型金属酶型金属酶 VIMVIM型金属酶型金属酶 与与IMPIMP类金属酶同源性类金属酶同源性 4040，但两类金属酶的但两类金属酶的动力学性质相似动力学性质相似，编码基因都位于整合子上编码基因都位于整合子上。目前目前VIMVIM型金属酶型金属酶GenBankGenBank上已公布上已公布1212种种，比较它们相互之间的比较它们相互之间的序列可将序列可将VIMVIM金属酶大致分为三组：金属酶大致分为三组：1 1）VIMVIM-1 1、4 4、5 5、1111a a 2 2）VIMVIM-2 2、3 3、6 6、8 8、9 9、1010、1111b b
16、3 3）VIMVIM-7 7 VIM型金属酶分布型金属酶分布 VIM-1 1999年年 意大利意大利 铜绿铜绿 氧化木糖产碱杆菌氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单恶臭假单胞胞 20032004希腊希腊 大肠大肠 肺克肺克 法国法国 肺克肺克 VIM-2 2000 法国法国 铜绿铜绿 意大利意大利 希腊希腊 日本日本 韩国韩国 葡萄葡萄牙牙 西班牙西班牙 波兰波兰 克罗地亚克罗地亚 智利智利 阿根廷阿根廷 美国美国 中国中国 VIM-3 2001年年 台湾地区台湾地区 铜绿铜绿 VIM-4 2002年年 希腊希腊 铜绿铜绿 2003 瑞典瑞典 铜绿铜绿 2004 意大意大利利 肺克肺克 阴沟阴沟 2004 波兰波兰 铜绿铜绿 VIM-5 2004 土耳其土耳其 肺克肺克 铜绿铜绿 VIM-6 2004 新加坡新加坡 恶臭假单胞恶臭假单胞 VIM-7 2004 美国美国 铜绿铜绿 VIM-8 哥伦比亚哥伦比亚 铜绿铜绿 VIM-9，10 英国英国 VIM-11 阿根廷阿根廷 意大利意大利 VIM型金属酶分布型金属酶分布 亚胺培南耐药铜绿亚胺培南耐药铜绿假单胞菌假单胞菌金属酶检测结果金属酶检测结果