1、深部真菌深部真菌(1(1-3)3)-D D-葡葡聚糖聚糖 快速定量检测快速定量检测 深部真菌感染深部真菌感染 深部真菌感染简介 定义定义:由致病性真菌所引起的人由致病性真菌所引起的人体深部感染，如侵及到皮肤深层体深部感染，如侵及到皮肤深层和内脏，如肺、粘膜、肌肉、脑、和内脏，如肺、粘膜、肌肉、脑、消化道等器官，危害性较大消化道等器官，危害性较大,称称为深部真菌感染。为深部真菌感染。类型类型:目前，深部真菌感染已成目前，深部真菌感染已成为免疫功能低下患者发病和死亡为免疫功能低下患者发病和死亡最常见的原因。最常见的原因。常见有念珠菌常见有念珠菌病、孢子丝菌病、隐珠菌病、曲病、孢子丝菌病、隐珠菌病、
2、曲霉病、毛霉菌病、马尔尼菲青霉霉病、毛霉菌病、马尔尼菲青霉菌病、组织孢浆菌病以及球孢子、菌病、组织孢浆菌病以及球孢子、副球孢子菌等临床病症。副球孢子菌等临床病症。黑曲霉黑曲霉 深部真菌感染诱因 诱发因素：诱发因素：(1)(1)慢性消耗性疾慢性消耗性疾 病，如恶性肿瘤、糖尿病和尿病，如恶性肿瘤、糖尿病和尿 毒症等，可使机体免疫功能和抵毒症等，可使机体免疫功能和抵抗力降低；抗力降低；(2)(2)长期使用广谱抗长期使用广谱抗生素，敏感的细菌被抑制，消除生素，敏感的细菌被抑制，消除了正常菌群中与真菌相拮抗的细了正常菌群中与真菌相拮抗的细菌，使真菌得以大量繁殖。有些菌，使真菌得以大量繁殖。有些抗生素可促
3、进某些真菌的生长，抗生素可促进某些真菌的生长，(3)(3)肾上腺皮质激素可抑制炎症肾上腺皮质激素可抑制炎症反应和纤维细胞增生，并可稳定反应和纤维细胞增生，并可稳定细胞内溶酶体的膜，阻止其中酶细胞内溶酶体的膜，阻止其中酶的释放，影响中性粒细胞和巨噬的释放，影响中性粒细胞和巨噬细胞溶解杀灭微生物的作用。细胞溶解杀灭微生物的作用。(4)(4)大剂量大剂量X X线照射、抗肿线照射、抗肿瘤药物和免疫抑制剂都能瘤药物和免疫抑制剂都能抑制骨髓，使中性粒细胞抑制骨髓，使中性粒细胞和巨噬细胞减少，机体的和巨噬细胞减少，机体的免疫功能和抵抗力降低。免疫功能和抵抗力降低。(5)(5)治疗用长时间静脉插管，治疗用长时
4、间静脉插管，留置导尿管和大手术，可留置导尿管和大手术，可引起局部损伤，成为真菌引起局部损伤，成为真菌侵入的门户，在机体抵抗侵入的门户，在机体抵抗力低落时在体内繁殖致病。力低落时在体内繁殖致病。深部真菌感染的诱因 免疫功能低下 深部真菌感染 组织局部损伤 菌群平衡 长期使用广谱抗生素 大手术、内脏插管 抗肿瘤药物使用 慢性消耗、免疫缺陷疾病 长期使用肾上腺皮质激素 X-R、抗肿瘤、免疫(-)某些内分泌失调：甲低 深部真菌感染的特点 1.不产生内毒素和外毒素，致病机理不明。2.致病力一般较弱，机体免疫低下时发生。3.感染菌种变化，白念珠菌感染下降。热带念珠菌，近平滑念珠菌，克柔念珠菌，光滑念珠菌等
5、感染增多。4.真菌感染早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高，真菌感染病学中写到，真菌院内感染死亡率为90%。深部真菌感染诊治中的问题 1.深部真菌感染发病率增加。2.误诊率高:1984年1997年，医院深部真菌误诊率30%，美国Muglistom1985年耳真菌病误诊率为90%。3.真菌感染与院内感染关系密切，美国80年代末真菌感染占院内感染的10%。4.危险因素多:年龄，肿瘤，移植，抗生素，激素等。5.抗真菌药物品种少，价格贵，因副作用而难以预防用药，耐药显现多。6.没有指导临床用药的可靠指标。北京协和医院真菌感染病例分布图北京协和医院真菌感染病例分布图 深部真菌感
6、染的临床检测 1.G实验：检测(1-3)-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染，耗时短，灵敏度高，特异性强。2.GM实验：曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测。判断是否曲霉属真菌感染。对儿童及接受造血干细胞移植患者、ICU患者不适用。3.真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测（PCR技术）用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点。1.直接方法：是组织或渗出物中可分离培养出致病真菌。特点：耗时长,并由于大量广谱抗生素的广泛使用，其培养阳性率也是很低。2.辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等。特点：观察期不确定，费时费力，特征性不明显，并对医师的专业水平要求高。传统检查 非传统检查
7、 深部真菌感染的药物治疗(1-3)-D-葡聚糖简介葡聚糖简介 1-3-D-葡聚糖本质及特点 葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，占其干燥重量的80%-90%。其中(1-3)-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分，其形式以1-3-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状1-6-D葡萄糖残基作为侧链。(1-3)-D-葡聚糖特性 当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。在浅部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量
8、不增高。对热极为稳定，高压121并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏，而隐球菌中含量较少，则需要较多的试剂才能检出。(1-3)-D-葡聚糖葡聚糖 定量测定定量测定 测定葡聚糖可以很快得到结果，指导临床医生采取积极的治疗,及时准确的选用抗真菌药物。动态快速检测，不受血中抗生素和酶等的影响。所有真菌的细胞膜上都含有(1-3)-D葡聚糖，而其他微生物、动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分，因此在机体的体液中检测到(1-3)-D葡聚糖是诊断深部真菌感染的有效依据。不能确定菌种，但能肯定是否有真菌感染。指导临床科学合理的使用抗真菌药物。当检测到标本中葡聚糖含量较高时，即刻
9、予以系统治疗，不必等鉴定出种属。定量测定(1-3)-D-葡聚糖的特点 样品来源：血浆，血清，腹水，尿液，脑脊液 定量测定(1-3)-D-葡聚糖的意义 早期诊断：早期诊断：深部真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。快速诊断：快速诊断：真菌感染就医的患者，往往病情严重，传统的微生物分离、培养与鉴定需要时间较长，患者在等待期间有可能病情加重，甚至死亡。指导用药：指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格适宜的药物提供准确的依据。评价效果：评价效果：
10、应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚糖浓度变化，评价选用药物的有效性。监护病程：监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。动态观察：动态观察：易感人群，临床疗效 动态浊度法原理 凝固蛋白原 凝固蛋白 动态浊度法 凝固酶 凝固酶原 活化因子C 因子C 细菌内毒素 因子G 活化因子B 活化因子G 1-3-D-葡聚糖 因子B 全过程全过程2小时内完成，可及时小时内完成，可及时 提供结果，指导临床提供结果，指导临床 定量测定(1-3)-D-葡聚糖的原理 不同浓度反应体系引起不同的浊度变化，当透光率达到法线时，该时间的对数（LgTg），与葡聚糖的浓度（LgC），呈直线关系 定量依据 定量测定(1-3
11、)-D-葡聚糖的设备(国内外现状国内外现状)国外现状国外现状 国内现状国内现状 美国、日本等国均已出现美国、日本等国均已出现专用的专用的(1(1-3)3)-D D葡聚糖葡聚糖检测仪器及配套的检测试检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得美国剂盒，而且获得美国FDAFDA及厚生省批准文号，作为及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。一种日常检测项目。美国美国:ELx808ELx808Incubating Incubating Microplate ReadersMicroplate Readers 日本日本:Wellreader SK603:Wellreader SK603 Toxinometer
12、MTToxinometer MT-55005500 MBMB-8080微生物动态微生物动态快速测定系统（金快速测定系统（金山川公司）山川公司）首家获得首家获得SDASDA认证认证 普及面广普及面广,影响大影响大.国内独创专利产品国内独创专利产品 计算机软件著作权计算机软件著作权 定量测定(1-3)-D-葡聚糖的设备 MB-80 微生物快速动态测定系统：主机反应器，数据处理分析软件，计算机，打印机，电子恒温加热仪等。生产商：北京金山川公司 国外检测仪器及试剂 日本生化学 Wellreader SK 603 国外-日本 日本和光 MT-5500 -Glucan test WakoGlucan te
13、st Wako 国外-美国 ELx808*Incubating Microplate Readers Glucatell Kit(13)-D-glucan Detection 定量测定定量测定(1(1-3)3)-D D-葡聚糖的试剂盒葡聚糖的试剂盒 GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒：真菌反应主剂（用于各种体液中真菌检测）及样品处理液（样品处理液的目的排除体液中存在的各种测定干扰物质）各5支。生产商：北京金山川公司 定量测定(1-3)-D-葡聚糖的附件 T01智能恒温仪 真菌检测专用真空采血管，采尿杯 无热原平底专用试管 生产商：北京金山川公司 MB-80的五大特点 生产商：北京金山川公司
14、 快速快速-2个小时完成检测 动态动态-动态检测 定量定量-定量检测 灵敏灵敏-内毒素最低检测量1pg/ml (1-3)-D-葡聚糖最低检测量5pg/ml 肽聚糖(PGN)最低检测量20ng/ml 检测不受病人用药影响检测不受病人用药影响 MB-80的技术指标 灵敏度：最小检出值5pg/ml 精密度：批间CV10%准确性：回收率平均75-125%标准曲线范围：5-9000pg/ml 相关系数r0.980 检测速度快：2小时内完成 测定(1-3)-D-葡聚糖的参考值 真菌定量检测试剂盒GKT-5M Set(定量)(1-3)-D-葡聚糖临床判断阀值为10pg/ml。检测值判读：10pg/ml以下：
15、健康人值 10-20pg/ml间：真菌定植病变观察期 20pg/ml以上：深部真菌感染，需采用治疗。敏感性与特异性为100%使用MB-80的临床评价 取一份真菌性肺炎病人标本，重复测定10次，真菌葡聚糖的CV值为6.7%。用公司提供的真菌葡聚糖标准品，测定5次，取均值然后计算相对误差为21.8%。取真菌葡聚糖的标准品，按照公司提供的检测范围，从5000pg/ml开始做10倍稀释，共稀释5次，进行检测，做直线回归分析，相关系数（r）为0.901。北京安贞医院感染科用金山川科技发展有限公司生产的MB-80微生物快速动态检测仪进行了初步的性能评价：使用MB-80的临床评价 北京安贞医院感染科使用金山
16、川公司生产的真菌葡聚糖试剂和日本和光公司生产的试剂，在MB-80微生物动态检测仪上做试剂的比对试验，结果见下表：使用MB-80的临床评价 关于真菌葡聚糖试剂的比对试验-病人 细菌培养结果 金山川试剂 和光试剂-65/M 白色念珠菌 86.2 84.6 76/M 热带念珠菌 36.2 33.5 22/F 毛霉菌 480.9 476.6 75/M 烟曲霉菌 265.1 235.4 81/M 热带念珠菌 31.5 36.2 78/F 光滑念珠菌 54.2 55.7 61/M 白色念珠菌 22.4 20.2 68/F 近平滑念珠菌 8.6 5.6-使用MB-80的临床评价 正常对照组血浆1-3-D葡聚糖含量为2.832.57 pg/ml；深部真菌感染组为54.0636.13 pg/ml。经t-检验分析，对照组与深部真菌感染组1-3-D葡聚糖平均值差异非常显著（t=7.741,P0.001）。血浆葡聚糖检测可在拟诊早期为临床医生提供是否感染真菌的可靠信息，是一种实用的真菌感染早期诊断方法。第四军医大学西京医院检验科MB-80微生物快速动态检测仪研究深部真菌感染患者血浆1-3-D葡聚糖检测与临床意