1、爆发性艰难梭菌结肠炎 王竞军 细菌简介细菌简介 难辨梭状芽孢杆菌(CD)又称艰难梭菌，属厌氧性细菌，一般寄生在人的肠道内。厌氧性细菌是指那些在无氧条件下要比在有氧环境中生长好的细菌，而人的肠道正好是一个相对无氧的环境。如果过度服用服用某些抗生素，艰难梭菌的菌群生长速度加快，影响肠道中其他细菌，引发炎症。艰难梭菌（Clostridiumdifficile)是梭菌属的一个成员，对氧十分敏感，很难分离培养，故得名。梭菌属成员很多，可分为几个群，其中有几个成员对人是致病性的。最著名的有产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和肉毒梭菌。产气荚膜梭菌可引起伤口气性坏疽、食物中毒、肌肉坏死、梭菌蜂窝织炎等，破伤风梭菌可引
2、起破伤风，肉毒梭菌可引起肉毒中毒。肉毒中毒的典型临床特征是急性弛缓麻痹，先从双侧颅神经阻碍开始，包括面部、头颅和咽部的肌肉，然后对称性下降，包括喉部和肢体肌肉。由于舌或咽部肌瘫痪可引起的呼吸困难，隔膜和肋部的瘫痪可能引起死亡。产气荚膜梭菌是一种常见的引起食物中毒的细菌。艰难梭菌发现于1935年，但直到1977年发现本菌与临床长期使用某些抗生素（氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等）引起的伪膜性肠炎有关，方被重视。艰难梭菌广泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型动物（牛、驴和马）的粪便，及狗、猫、啮齿动物和人的粪便，除此之外还大量存在于水和动物的肠道中婴儿的粪便中常含有艰难梭菌，为
3、新生儿肠道中正常菌群，大约50%12月龄婴儿的肠道中有艰难梭菌，2岁以上儿童的带菌率大约为3%，但此菌在健康成人中出现频率较低，无症状带菌的成人在瑞典是1.9%，在日本为15.4%爆发性艰难梭菌结肠炎定义 爆发性艰难梭菌结肠炎（FCDC）由美国匹斯堡医学中心（UPMC）的Dallal等于2002年提出。定义为因感染艰难梭菌引起严重腹泻、伪膜性肠炎、中毒性巨结肠、结肠穿孔、感染性休克、多器官功能障碍或死亡等全身中毒症症状严重的艰难梭菌结肠炎，该病常需要重症监护、血管活性药物支持、机械通气及外科手术治疗。发病率 CD是一种可形成孢子的革兰氏阳性厌氧菌，其致病性已经超过MRSA，成为最常见的院内感染
4、致病菌株，尤其是院内感染性腹泻的最主要原因。美国一项调查研究显示，每年约有300万患者感染CD，其发病率由2004年的8.8/1000上升至2015年的14.7/1000，平均每年增长4%。在所有抗菌药物相关性结肠炎中，CDC约占15%25%，重症加强病房中CDC发病率约为1.5%-4.8%。新近的研究表明，CD突变株NAP1/BI/ribotype027具有高致病性，可能导致全球流行和爆发。虽然大部分CDC患者经口服抗感染药物可获得有效控制，但约3%10%的患者可发展为FCDC。经过重症监护、血管活性药物支持、机械通气等治疗后，仍有高达20%的FCDC患者需要进一步外科手术治疗，且临床研究显
5、示，FCDC术后病死率高达35%80%。因此，FCDC仍然是一种临床其需解决的高致死性疾病。FCDC的风险因素 广谱抗菌药物的使用，尤其是氨苄西林、阿莫西林、头孢菌素、克林霉素、氟喹诺酮、亚胺培南、美罗培南等药物，常被认为是FCDC发病的基本风险因素。而且，FCDC的发生与特定抗菌药物的剂量、频次、给药途径及药物对典型肠道正常菌群的影响等因素有关。FCDC的其他潜在风险因素还包括高龄、合并多器官或主要器官疾病、危重症监护、低蛋白血症、肾功能不全、肠梗阻等。激素或免疫抑制剂、抗胃肠蠕动药物、胃肠道内镜检查或手术、鼻饲营养也可促使FCDC的发生。FCDC的发病机制 据统计，在社区无症状或成人慢性肠
6、道CD携带者约占03%；住院患者的CD定植率高达20%40%。在医院和长期护理设施环境内，CD可经孢子传播方式及粪-口途径是感染者和医护人员的手及医疗设施成为主要感染源。另外，抗菌药物的使用可破坏肠道正常菌群，此时定植的CD可在肠道内生长、过度繁殖，并向结肠黏膜内释放毒素A和毒素B，二者被肠粘膜上皮细胞吸收后，经细胞毒性和（或）激活炎症“瀑布”反应，包括激活核转录因子-B（NF-B）、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）及环氧化酶-2（COX-2）等因子，促使前炎性细胞因子白细胞介素（IL-1、IL-8）、肿瘤坏死因子-（TNF-）等释放，引起结肠损害和局部炎症，从而导致FCDC的发生。有些定植在肠
7、道内的CD还可产生二元毒素（一种腺苷二磷酸核糖基转移酶）。已经有研究证实，二元毒素可通过形成微管突起促进CD与靶细胞之间的粘附。另外，代谢活跃的生长期CD还可通过表达固有免疫毒力因子参与FCDC的发病，这些因子的致病作用有：鞭毛：鞭毛可调节CD的趋化性和穿透粘液层的能力，促进细菌与上皮细胞之间的粘附；表层蛋白：表层蛋白尤其是表层蛋白A可使细菌逃逸宿主的免疫反应。在上述致病因子的相互作用下，受损的宿主细胞发生坏死，血管通透性增加，中性粒细胞浸润，导致白细胞计数升高、严重腹泻、脱水、低蛋白血症、中毒性巨结肠、休克，甚至死亡。CD 的主要毒力因子为肠毒素 A(308 kD)和细胞毒素 B(270 k
8、D)，两者均由 N-端葡萄糖基转移酶催化区(glucosyltransferase domain，GTD)、半胱氨酸蛋白酶活性 区(cysteine proteinase domain，CPD)、跨 膜 区(transmembrane domain，TMD)和 C-端 受 体 结 合 区(receptor binding domain，BD)组成。其毒素作用的分子机理为:(1)毒素受体结合区(C 端重复序列)与细胞受体特异结合;(2)毒素-受体形成复合物并引发细胞内吞噬作用;(3)酸性环境使毒素构象发生变化，使毒素的跨膜区插入到细胞膜中并形成孔道;(4)毒素在某些细胞因子的共同作用下，发生自我
9、切割，产生 易 位 作 用，将 毒 素 的 GTD 释 放 到 胞 质 内;(5)GTD 发挥催化作用使 ho GTP 酶家族糖基化，GTP结合蛋白失活，靶细胞肌动蛋白细胞骨架解聚，细胞通透性增加，细胞内物质外流，产生炎症，最终导致细胞死亡、肠壁坏死、液体积蓄、出现水样腹泻，坏死的肠壁细胞和炎症细胞在肠黏膜上形成伪膜。FCDC的诊断标准 CDI 诊断标准为:患者出现中至重度腹泻或肠梗阻，每24h排出水样无血便3次，并满足以下任一条件:(1)粪便检测 CD 毒素或产毒素 CD 结果阳性;(2)内镜下或组织病理检查显示伪膜性肠炎。FCDC的诊断 FCDC具有特征性的临床表现，即每24h排出水样无血
10、便3次。除特征性腹泻外，FCDC的临床表现还包括：严重的下腹部或弥漫性腹痛、腹胀、发热、血容量不足，甚至导致结肠穿孔、中毒性巨结肠、全身炎症反应综合证（SIRS）、脓毒症或肾功能衰竭、呼吸衰竭、心功能不全等。病原学检查 1.粪便标本采集 一般情况下，仅需对稀便、水样便或半成形便进 行 CD 检测。对于疑似有 CD 感染及肠梗阻的患者，应 通过直肠拭子进行检测。在出现明显腹泻症状(3 次/24 h、持续超过 2 d)及进行针对性治疗前，采集 不成形粪便标本(推荐 10 20 ml，不少于 5 ml)送 检。CD 毒素室温下易降解，应于取材后 2 h 内送检并 立即检测;如不能立即检测，则需将标本
11、置于 4 冰 箱保存，不超过 3 d。2.艰难梭菌菌株检测 (1)培养 常采 用 CCFA 培 养 基(cefoxitin cycloserine fruc-tose agar，CCFA)或 CD 显色培养基进行厌氧培养。CCFA 培养基需培养 48 72 h，对粪便标本通过加热或乙醇预处理可以减少粪便正常菌群，筛选出细菌芽孢。CD 在 CCFA 上具有典型的“马粪”气味，菌落在紫外光下显示黄绿色荧光，典型的菌落可使用API 20A、Vitek 2 Compact 或者 MALDI-TOF MS 技术等进行鉴定。使用 CD 显色培养基可以缩短培养时间至 18 24 h，且无需对粪便样本进行加热
12、或乙醇等预处理。CD在显色培养基上的菌落具有黑色、扁平、粗糙、边缘不整齐的特点，同时可以达到直接鉴定 CD 的目的。厌氧培养敏感度较高，但不能区分菌株是否产生毒素，可作为难辨梭菌筛查的有效方法之一，菌株可用于流行病学调查。(2)谷氨酸脱氢酶检测 谷氨 酸 脱 氢 酶(glutamate dehydrogenase，GDH)是所有 CD 高水平表 达 的 代 谢 酶，可 用 于 筛 查 疑 似CDI 患者粪便样本中是否存在 CD。通常使用酶免疫方法(enzyme immunoassays，EIAs)直接检测粪便标本中的 GDH 抗原。检测时间约 1 2 h，操作简便且成本较低。系统综述显示该试验
13、具有较高的敏感度(90%)、特异性(90%)和阴性预测值(95%100%)，但同 CD 培养一样，不能区分菌株是否产生毒素，近 20%的 GDH 阳性患者的 CD 不产生毒素。该方法可作为一种高度敏感的初筛试验，GDH 试验阴性，可直接报告临床用于排除 CDI;GDH 试验阳性，需要进一步检测其毒素或毒素基因进行确证。3.艰难梭菌毒素检测 (1)细胞毒性试验 细胞毒性试验(cell cytotoxicity assay，CCTA)，即细胞毒性中和试验(cell cytotoxin neutralization assay，CCNA)，用于直接检测粪便标本中存在的 CD 毒素。将不成形稀便标本离
14、心，上清经 0.45 m 滤膜过滤，将无菌 PBS 稀释的粪便滤液加入细胞悬液(Vero 或Hep2 细胞等)，分别加入和不加入抗 CD 毒素的中和抗体，37 5%CO2 环境培养，24 h、48 h 后显微镜下观察细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)，而加入特异性抗毒素抗体能阻止这种细胞病变。CCTA 是实验室诊断 CD 的金标准，特异性强，敏感度高(最低可检测出 10 pg 毒素)，但需要细胞培养及显微镜观察的 相 应 设 施 和 技 术，操 作 繁 琐，耗 时 长(48 72 h)，判定结果需要一定经验的技术人员，不适宜临床常规检测。(2)产毒素培养 产毒素培养(to
15、xigenic culture，TC)用于检测 CD菌株的产毒素能力。将不成形稀便标本接种于 CCFA培养基或 CD 显色培养基上，37 厌氧培养至少48 h，挑取典型菌落接种至液体培养基中，厌氧培养 48 h，0.45 m 滤膜过滤培养上清进行细胞毒性试验。也可用 EIAs 检测固体培养基上菌落产毒素能力，检测时间可缩短至 2 3 d，但敏感度稍低。TC 是实验室诊断 CD 的参考方法，敏感度高，特异性强，但操作繁琐，耗时长(5 d 左右)，结果判读的技术人员需要有一定经验，不适宜临床常规检测，可用于流行病学监测，并作为评价其他检测方法的参考标准。(3)毒素免疫检测 目前常用 EIAs 直接
16、检测腹泻粪便标本中的 CD 毒素，用单克隆抗体特异性结合 CD A/B 毒素蛋白进行检测。EIAs 检测 CD 毒素的优点是特异性高(90%)，能区分产毒株和非产毒株，并且检测周期短，数小时即可出结果，操作简便，应用广泛;缺点是敏感度较低(39%76%)，不 能 单 独 用 于 CD 感染的实验室诊断。目前，EIAs 检测 CD 毒素常和 GDH 检测或核酸扩增技术(nucleic acid amplification tests，NAATs)联合应用，用于 CD 感染实验室两步法或三步法诊断。4.艰难梭菌毒素基因检测 可采用实时 PC 或环介导等温扩增法(loop-me-diated isothermal amplification，LAMP)等分子生物学技术，定性检测粪便样本中的 CD 毒素基因。商品化的检测系统包括 GeneXpert(Cepheid，美国)、FilmArray(梅里埃，法国)等，此类方法将样品提取、纯 化、核酸扩增、产物自动化检测整合，通常可在 2 h 内完成检测。此外，GeneXpert 可以检测 tcdC 基因的突变和缺失，预测高产毒菌株 T027 型 CD