1、神经细胞体外培养神经细胞体外培养方法及应用方法及应用 田东萍田东萍 汕大医学院病理教研室汕大医学院病理教研室 神经细胞体外培养的历史神经细胞体外培养的历史 神经组织的体外培养方法是由神经组织的体外培养方法是由HarrisonHarrison，于于19071907年首年首创的创的。由于该方法具有简化细胞生化环境由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。九十余年来九十余年来，这项技术已从组织块这项技术
2、已从组织块（或植块或植块）培养培养（explantexplant cultureculture）发 展 到 分 离 细 胞 培 养发 展 到 分 离 细 胞 培 养(dissociateddissociated cellcell culture)culture)，并逐渐与多种现代技并逐渐与多种现代技术结合起来术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用在神经科学各领域发挥了重大作用。组织块培养组织块培养分离细胞培养分离细胞培养甚至单一型细胞培养甚至单一型细胞培养 神经组织的植块培养法神经组织的植块培养法 悬滴培养方法悬滴培养方法 单盖玻方法单盖玻方法 双盖玻方法双盖玻方法 1925 改良双盖玻方
3、法改良双盖玻方法 培养物：培养物：CNS灰质灰质、白质白质、外周神经节或神经小段外周神经节或神经小段 突起突起 非神经元外伸非神经元外伸 优点优点 所需培养液量少所需培养液量少，可反应组织代谢中可反应组织代谢中 微量生化改变微量生化改变 保留了植块内组织特征保留了植块内组织特征 不足不足 培养空间小培养空间小，O2 CO2供少供少 培养空间湿度难以控制培养空间湿度难以控制，水分会蒸发水分会蒸发 密封手续繁杂密封手续繁杂，不利更换培养液不利更换培养液，难难 以观察单个神经元生长以观察单个神经元生长。神经元的分离细胞培养方法神经元的分离细胞培养方法 1956年年，Nakai首创了神经组织的分离培养
4、方法首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低形态学分化和化学分化程度低，体外存活强体外存活强，成熟后则相反成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤且神经元会受到大的普遍损伤。部位：部位：灰质、灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大神经节，神经元集中，密度大 神经元的体外培养液神经元的体外培养液 天然合成成分天然合成成分 血清血清 血浆血浆 胚胎撮液胚胎撮液 人工培养基人工培养基 无血清培养基无血清培养基 化学限定性培养基化学限定性培养基 常用的：常用的：DMEM+添加剂添加剂 F
5、12 葡萄糖葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源为神经元能量代谢主要来源 3333mmmm COCO2 2 NaHCONaHCO3 3缓冲系统重要缓冲系统重要 HEPESOHEPESO2 2耗量更耗量更高高 K K+神经元生理活动的重要离子神经元生理活动的重要离子，K K+是神是神经元存活所必需的经元存活所必需的，K K+2424.5 5mMmM 能提高能提高神经元存活神经元存活，促分化促分化 非神经元成分的抑制非神经元成分的抑制 有有 2 2-3 3天天 神经元无血清限定培养液神经元无血清限定培养液 人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类
6、本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长培养液中即使能够存活也为期不长，更难以更难以分裂分裂。因此可根据神经元的特性因此可根据神经元的特性，给基础培给基础培养中再添加某些特殊物质养中再添加某些特殊物质。选择添加剂的基本过程选择添加剂的基本过程 限定连续细胞系的体外生长条件限定连续细胞系的体外生长条件。试定该细胞系来源的细胞的培养试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件液条件。BottensteinBottenstein实验室经过长期研究发实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好现如下
7、添加剂比较好 人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到加入到F F1212与与DMEM 1:1DMEM 1:1混液中，可以代替血清混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠添加物，用来培养大鼠CNSCNS的成神经细胞瘤细的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为代号分别为N N1 1、N N2 2、N N3 3。NN1 1的配方为的配方为 胰
8、岛素胰岛素5g/ml 转铁蛋白转铁蛋白5g/ml 孕酮孕酮20 nM 腐胺腐胺100Um 硒硒30nM 神经体外培养的生长基质神经体外培养的生长基质 胶胶 元元 多聚赖氨酸多聚赖氨酸 LN 神经细胞培养操作程序表神经细胞培养操作程序表 脊髓后根节脊髓后根节 大脑皮质大脑皮质 孕孕1820天大鼠胚胎天大鼠胚胎 新生新生13天大鼠天大鼠 在在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜液中取出组织除去脑膜 与与CMF-Hanks 液一起移至离心管液一起移至离心管 舍弃舍弃CMF-Hanks液，再加入液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶和5滴滴0.2%Dnase液液 370C，30min 舍弃胰
9、蛋白酶，加入舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和培养液和10滴滴Dnase液液 用巴斯德吸管吹打用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次次 若有组织残渣，将上清移至新试管再加若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打培养液反复吹打 将细胞悬液收集于离心管，离心将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min，8min，舍去上清，向舍去上清，向沉淀加培养液，离心沉淀加培养液，离心1200r/min，8min 加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1 110107 7 种入涂有种入涂有
10、polypoly-D D-lysinelysine的盖片上，每片的盖片上，每片5050 l l 放入放入CO2孵箱中过夜孵箱中过夜 次日加次日加3ml培养液培养液 2 2天后（培养的第三天）换入有天后（培养的第三天）换入有DNADNA合成阴断剂的培养液合成阴断剂的培养液 神经元的分离培养过程神经元的分离培养过程 大鼠大脑皮层神经组织细胞培养大鼠大脑皮层神经组织细胞培养 组织来源组织来源 新生大鼠新生大鼠1-2日龄日龄，碘碘 酒酒，洒精消毒洒精消毒。断头断头，取出大脑取出大脑，分离脑分离脑 膜膜，夹取两侧大脑皮质放夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中入接种培养液中，用用D-Hanks冲洗二遍冲洗二遍
11、。剪碎剪碎，0.5-1mm3,用用D-Hanks充分洗去残血充分洗去残血 加入加入5-10倍量倍量0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶，移入离心管中放到水移入离心管中放到水370C浴箱中消化浴箱中消化20-25分钟分钟。终止消化离心洗涤终止消化离心洗涤 2000转转/分分，5分钟弃上清分钟弃上清。吹打吹打制成细胞悬液制成细胞悬液。台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中孔板中。370C 5%CO2培养培养2天后换生长培养液天后换生长培养液 大鼠海马神经细胞培养方法大鼠海马神经细胞培养方法 神经元体外生长特征神经元体外生长特征 接种密度与体外存活率接种密度与体
12、外存活率 当当96孔孔 每孔每孔2000-3000个个 或或 7000-10000个个/cm2几乎无神经元存活几乎无神经元存活 当当8000-12000个个/96孔孔 或或 2.8万万-4万个万个/cm2 存存活率最大活率最大。3天后不到接种的一半天后不到接种的一半，故研究某一生长因子故研究某一生长因子前前3天加药最好天加药最好 神经元的体外存活时间神经元的体外存活时间 短短1-2W 长长 4个月个月 体外分化标志体外分化标志 破伤风毒素破伤风毒素 NSE NF200,NF160 神经细胞的特殊染色鉴定方法神经细胞的特殊染色鉴定方法 尼氏体染色尼氏体染色 焦油紫焦油紫 甲苯胺蓝甲苯胺蓝 硫瑾等
13、组化染色硫瑾等组化染色 镀银染色镀银染色 NADPH-d特异性神经组织化学法特异性神经组织化学法 神经细胞培养的应用神经细胞培养的应用 应用领域应用领域 研究各种因素对神经的影响研究各种因素对神经的影响 1.化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。2.药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），），神经营养因子神经营
14、养因子 3.细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。4.各种生理病理状态下神经元状态改变各种生理病理状态下神经元状态改变 实验方法实验方法 研究手段及测量指标研究手段及测量指标 1.形态学观察：形态学观察：光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。电镜：超微结构。2.激光共聚焦扫描显微镜（激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope,LCSM)：研究细胞内成分变化，离子改变研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建等，三维重建 3.膜片钳技术，
15、细胞表面通道和离子流动，电变化。膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。研究手段及测量指标研究手段及测量指标 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化 5.染色：苏木素染色：苏木素-伊红（伊红（HE）染色及尼氏（染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色。染色，免疫组化染色。6.显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。长度及胞径。7.荧光光度分析仪：荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的法测定细胞的OD值值 培养神经细胞的观察和鉴定培养神经细胞的观察和鉴定 1.1.神经细胞培养存活的标志：种植神经细
16、胞培养存活的标志：种植2424小时后贴小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。都能存活。2.2.特殊培养阶段：培养的特殊培养阶段：培养的9 9到到1212天之间，有较多天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触。互相形成网络，电镜下可见突触。3.3.形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突细长均匀，直径恒定。突细长均匀，直径恒定。研究范围研究范围 细胞凋亡细胞凋亡 细胞生长状态细胞生长状态 存活率存活率 膜流动性膜流动性 基因产物表达基因产物表达 细胞内酶活性细胞内酶活性 细胞内离子含量变化细胞内离子含量变化 细胞表面受体，等等细胞表面受体，等等 放映完毕放映完毕 请多指教请多指教