1、 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/凝血酶治疗新生儿消化道出血31例河南省新乡县人民医院(453731)崔兴杰 史百川 张雅惠 摘要 目的:观察凝血酶治疗新生儿消化道出血的疗效。方法:凝血酶200u溶于生理盐水510ml,胃管送入,每隔2小时1次,连用35次。结果:显效22例,有效8例,无效1例,总有效率9618%。结论:应用凝血酶治疗新生儿消化道出血,疗效显著,治疗未出现严重的不良反应。关键词 凝血酶 新生儿消化道出血 新生儿消化道出血是一种儿科常见且严
2、重危及新生儿生命的疾病之一,我科自1999年3月2002年3月三年间,应用凝血酶治疗新生儿消化道出血31例,取得满意效果,现报告如下:1 临床资料111 一般资料:本组均为住院病例,31例中男17例,女14例,足月顺产新生儿5例,早产17例,低出生体重儿6例,难产儿5例,原发病为新生儿窒息10例,缺氧缺血性脑病5例,颅内出血3例,胎粪吸入综合征7例,首发消化道出血6例,呕血,排柏油样便7例,伴休克及全身衰竭1例,血红蛋白均降低,最低达63g/L,血小板 6min 2例,凝血酶原时间 22s 2例。112 方法及结果全部病例均给予静脉注射维生素K1,出血量大或重度贫血者予以输血,在上述治疗的同时
3、,给予凝血酶200u溶于生理盐水510ml,胃管送入,每隔2小时1次,连用35次。113 疗效评定标准:显效:连用35次后,未再呕血,大便从柏油样转为黄色或从暗红色转为柏油样;有效:连用35次后,呕血减少,原排暗红色血便改排柏油样便,持续2天以上者,或显效后再发少量出血,按原方案治疗后,达显效者;无效:连用35次后,未达到有效标准或加剧者。31例中,显效22例,有效8例,无效死亡1例。总有效率9618%,治疗中未发现毒副反应。2 讨论新生儿消化道出血是一种常见病,尤其在早产儿,低出生体重儿和各种危重病患儿更易发生,因为这些新生儿血小板破坏增加而致血小板减少,或因维生素K依赖性凝血因子缺乏,或因
4、血管壁薄弱,脆性高,易于损伤,容易引起消化道出血。再者危重病患儿易发生消化道溃疡而致消化道出血。凝血酶是一种局部止血药,它在接触出血病灶后会形成条索状凝固膜,有收敛作用和促进平滑肌收缩,降低毛细血管通透性,减轻局部水肿,起止血作用,同时它能直接作用于纤维蛋白原,促进溶胶状态的纤维蛋白原迅速生成不溶性纤维蛋白,堵塞出血点,它还能促进血小板发生不可逆性聚集,并释放血小板因子、ADP及血栓收缩蛋白增加因子、的活性,激活因子 活化,使疏松的纤维蛋白凝块变成紧密的纤维蛋白块,起加固止血作用。所以,凝血酶对新生儿各种原因引起的消化道出血有确切可靠的止血作用,并且无毒副作用,值得推广应用。(收稿日期:200
5、3-12-02)细菌DNA提取方法比较解放军第153中心医院儿科(郑州 450042)沈德新 封志纯 杜 江 摘要 目的:比较细菌DNA4种提取方法的优缺点。方法:采用水煮法、传统法、Genmiction DNA Kit法、E.ZNA法分别制备18种细菌DNA,比较4种方法提取DNA纯度及量的差异。结果:4种方法制备的DNA均可成功应用于PCR扩增,水煮法与E.ZNA法提取DNA量都较大,但前者纯度低于后者;Genmiction DNA Kit法提取DNA纯度高,但量较低;传统法提取的DNA量及纯度均较低,但经济、可靠。结论:4种方法各具特点,应根据实验目的选用。关键词 细菌 DNA提取 细菌
6、DNA分子水平诊断是临床医学发展趋势。目前,细菌DNA提取方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的量及纯度各不相同,本文对四种不同DNA提取方法进行比较,旨在为合理选取DNA提取方法提供指导。1 材料与方法111 材料11111菌株来源:18种菌株,其中金黄色葡萄球菌26112、ATCC 27154,绿脓假单胞菌ATCC 27316、ATCC 27853,产气肠杆菌45103,阴沟肠杆菌45301,大肠埃希氏菌ATCC25922、44106、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031,肺炎链球菌31126,表皮葡萄球菌26069,乙型溶血性链球菌32210,费劳地枸橼酸杆菌48008,婴儿沙
7、门氏菌50204,流感嗜血杆菌NCTC7279,粪链球菌ATCC 14506,葡萄球菌26103等17株购自北京药品生物制品检定所,金黄色葡萄球菌ATCC 25923购自中山医科大学微生物室。11112 主要试剂:溶菌酶、蛋白酶K、CTAB、平衡重蒸酚、Tris、SDS(均购自华美公司,为分析纯);EDTA、丙酮、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、无水乙醇(均为广州市化学试剂厂生产的分析纯),Genomic DNA Kit(Fermentas公司生产),E.ZNA kit(Omega公司生产),100bpMarker(申能博彩),DNA扩增试剂盒02中原医刊2004年5月第31卷第10期 Centra
8、l Plains Medical Journal May.2004,Vol 31,No.10 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/及TaqDNA多聚酶(购自欧瑞卡)。11113 主要仪器:梯度PCR扩增仪(德国Biometra公司产品),紫外分光光度计(Beckman DU-520),TGL-16G台式高速离心机(医用分析仪器厂生产),凝胶图像分析仪(GELDOC1000,BIO-RAD公司产品),紫外透射仪(天能科技公司生产),H6微型电泳槽,电热恒温水浴
9、锅C286型,-20 冰箱。11114 引物设计:通过Internetd检索在Genebank中所有常见细菌16SrRNA的基因序列,利用dnastar软件设计一对细菌的共同引物:上游:5tcctacgggaggcagcagt3 下游:5tggac2taccagggtatctaatc3 由上海生物工程公司合成。PCR扩增片段大小为468bp.112 方法11211细菌DNA提取:取含118108菌的菌液加入115ml的离心管中7500rpm/min离心5min,弃上清。1121111 水煮法1:革兰氏阴性杆菌沉淀加入016ml无菌去离子水,振荡混匀,100水浴10min后离心,上清作为DNA模
10、板-20 保存备用。革兰氏阳性菌及革兰氏阴性球菌沉淀加入800ul丙酮后混均,放入-20冰箱中冰浴10min,7500rpm/min离心5min,弃上清,沉淀在室温下放置5min,使丙酮蒸发干。再加入TE 100ul、10mg/ml溶菌酶100ul,37 温育20min,离心,沉淀加入TE600ul重悬,再加入15mg/ml蛋白酶K25ul,55 温育1h后煮10min,离心,上清作为DNA模板-20 保存备用。1121112传统法2:细菌沉淀加入TE567ul重悬,加入10%SDS 30ul和20mg/ml蛋白酶K 3ul,于37 温育1h,加入5mol/L NaCl 100ul,CTAB/
11、NaCl 80ul溶液,于65 温育10min,加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,离心5min。上清液转入一个新管加等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5min,上清液再转入一只新管中,加入016体积异丙醇,轻轻混合,离心5min,弃上清,加入70%乙醇洗涤1min,离心,弃上清,将沉淀的DNA溶于100ul的去离子水中,-20 保存备用。1121113Genomic DNA Kit方法:TE 200ul重悬细菌沉淀,加入试剂盒提供的lysis solution 400ul 65 孵育5min,加入氯仿600ul,混均,离心2min,上清转入事先准备好的加入消毒去离子水720ul及试剂盒提供的p
12、recipitation solution 80ul新的离心管,室温下放置2min,离心2min,弃上清,再加入试剂盒提供的112M Nacl Solution100ul及冷乙醇300ul,-20放置10min,离心4min,弃上清,去离子水100ul溶解DNA,-20 保存备用。1121114E.ZNA Kit法:TE100ul重悬细菌,革兰氏阴性细菌加入10mg/ml溶菌酶,革兰氏阳性细菌加入100mg/ml溶菌酶,30孵育10min后离心,弃上清。用试剂盒中提供的Buffer BTL 200ul重悬细菌,加15mg/ml蛋白酶K 25ul,55 水浴1h,加入试剂盒提供的Buffer B
13、DL 220ul,70 水浴10min,加入无水乙醇220ul,混均,转入试剂盒提供的Hibind自旋柱内,自旋柱装入新的2ml离心管内,离心1min,弃离心管,柱子重新装入新的2ml离心管中,加DNA Wash Buffer750ul于柱中,离心1min,弃离心管。把柱子置于115ml离心管中,并加入70预热的去离子水200ul,柱子在室温下放置1min,离心1min,收集从柱子上洗脱的DNA,重复上一步,共收集DNA溶液400ul,-20 保存备用。11212DNA纯度、质量检测:取细菌DNA 20ul,TE稀释至100ul,在紫外分光光度计下测量A260nm、A280nm OD值,计算D
14、NA纯度、质量。11213 细菌DNA扩增:将上述4种方法提取的细菌DNA作为模板加入总体积为50ul的反应体系中:5butter 10ul,2.5mmol/L dNTP,5uM上游引物5ul,5uM下游引物5ul,DNA模板8ul,Taq酶115u,加去离子水至50ul,混均。95 变性5min,30个循环9440s,5530s,7240s;最后一个循环72 延伸5min。取8ul PCR反应产物,115%琼脂糖凝胶(60V)电泳40min,置紫外透射仪下观察DNA特异性条带。113 统计学处理:采用SPSS1010软件进行完全随机设计的方差分析,各组间两两均数的比较用Drnnetts法。2
15、 结果2114种方法提取的细菌DNA量和纯度分析结果见表1。表14种方法提取细菌DNA纯度和产量比较 方法细菌样本数(N)纯度(OD260/280)(XSD)产量(ugDNA/107菌)(XSD)水煮法181.700.10241.9222.353 传统法181.720.1335.889.72Genomic DNA Kit法181.870.103 27.8819.09E.ZNA kit181.940.063 106.4192.523 注:3 与传统法比P 0105,与Genomic DNA kit法比P 0105,与水煮法比P 0105,与E.ZNAkit比P 0105。212 细菌DNA扩增:
16、4种方法均扩增出468bp目的基因,扩增效果见图1,PCR产物无拖带与杂带,得到满意的扩增效果。图1 细菌DNA为模板PCR扩增产物电泳结果注:DNA模板:1、5、9、13为金色葡萄球菌ATCC 27154,2、6、10、14为绿脓假单胞菌ATCC 27316,3、7、11、15为肺炎克雷伯氏菌ATCC10031,4、8、12、16为肺炎链球菌31126;DNA提取方法:14为E.ZNA kit法,58为Genomic DNA Kit法,912为传统法,1316为水煮法;17为100bpMarker2134种方法提取细菌DNA的步骤、时间、费用见表2。表24种方法所用的步骤、平均时间、成本费比较水煮法传统法Genomic DNA Kit法EZN.A Kit步骤数147512时间(min)151201203090成本(元/份)01521515103 讨论细菌DNA提取方法有多种,不同的方法提取的量及纯度不同,所需要的时间及经费也有差别,而不同实验应用的目的要求也各异。比较4种方法优缺点,为合理选择DNA的提取方法提供指导。4种方法制备的DNA均成功应用于PCR扩增,扩增产物12中原医刊2