1、实验实验5 果蝇唾腺染色体的观察果蝇唾腺染色体的观察 一一 实验目的实验目的 1练习取出果蝇幼虫唾腺的技术和制作唾腺染色体标本的方法。2了解体细胞染色体联会现象，观察果蝇唾腺染色体的形态特征，并根据唾腺染色体上横纹的形态和排列，识别不同的染色体。3识别染色体结构变异的细胞学表现。二二 实验原理实验原理 本世纪初，D.Kostoff用压片法首先在果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体唾液腺染色体（salivary gland chromosomes）。由于它具有许多重要特点而成为细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学和分子遗传学研究中不可多得
2、的好材料。果蝇是双翅目昆虫，幼虫期具有很大的唾腺细胞，果蝇是双翅目昆虫，幼虫期具有很大的唾腺细胞，其中的染色体是巨大的唾液腺染色体。其中的染色体是巨大的唾液腺染色体。唾液腺染色体不断地进行自我复制而不分开，经唾液腺染色体不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约过许多次的复制形成约10004000拷贝的染色体拷贝的染色体丝，合起来达丝，合起来达5mm宽，宽，400mm长，比普通中期相长，比普通中期相染色体大得多（约染色体大得多（约100150倍），所以又称为多倍），所以又称为多线染色体。线染色体。唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多
3、方面，如染色体结构、化学组成、基因差的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。别表达等提供了独特的研究材料。果蝇种间或种内不同品系与近缘种之间的遗传差异常表现为唾液腺染色体不联会，形成泡（puff）、缢痕（constrictions）、间带区（interband）的伸缩性以及顶体（telomere）的形态等多方面的变异，特别重要的是可观察是否产生了倒位、染色体的断裂、融合或重排，据此研究其基因序列的差异。因此，无论从细胞遗传学的角度研究基因与突变性状之间的关系，还是从进化遗传学方面研究染色体的系统发育，探讨近缘种间的遗传差异和生殖隔离机制等，唾液腺染色体的分析研究
4、都是十分重要的。果蝇唾液腺染色体已广泛用于种内系统发育和种间亲缘关系的研究中。普通果蝇（2n=2x=8）唾腺染色体的特点表现在：各染色体着丝点附近异染色质区相互结合形成染色很深的染色中心，第、对染色体呈形（中着丝粒），各有两臂，染色体呈棒状，第对染色体呈粒状，观察时可见五条臂由染色中心向外蜿蜒伸展。三三 实验材料实验材料 果蝇三龄幼虫活体。四四 实验器具、药品试剂实验器具、药品试剂 显微镜，生化培养箱；果蝇培养瓶，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，吸水纸等。0.7氯化钠（NaCl），1mol/L HCl；改良苯酚品红染色液；果蝇培养基等。五五 实验方法实验方法 1培养果蝇三龄幼虫 将果蝇放在营养丰
5、富的培养基中，1518下饲养，幼虫要生长肥大，才能获得较大的唾腺。培养要求：饲料松软，含水量较高，营养丰富，发酵良好（建议配方：玉米粉10g，红糖13g，琼脂1g，酵母粉2g，丙酸34滴，加蒸馏水100120ml）。追加酵母液。在一龄幼虫出现后，将成虫移入另一培养瓶中，在饲料表面滴加低浓度的酵母液（24.5），每天滴加12滴；2龄3龄幼虫时期适当增加酵母液的浓度（约10左右）；滴加的量以覆盖在饲料表面薄薄的一层为宜。控制幼虫的密度。一般情况下，半磅牛奶瓶中10对成虫交配后在12h左右必须将成虫转移，一般要求每cm2培养基表面2040只幼虫左右。低温培养：稍低的温度有利于幼虫的充分生长发育，一般
6、1518较为合适。2取唾腺取唾腺 挑选生长肥大的三龄幼虫放入表面皿中用0.7的生理盐水尽量洗去幼虫体表所沾附的培养基，然后将幼虫置载玻片上，滴2滴0.7生理盐水，找到具有口器的头部（有一小黑点），一手用解剖针刺入（或压住）头部，将虫固定，一手用摄子夹紧幼虫下半部（尾端1/3处），轻轻向两端拉开，唾腺随头部拉出。唾腺是一对透明的棒唾腺是一对透明的棒状腺体，外有白色的脂肪组织（不透明）。去除幼虫其它状腺体，外有白色的脂肪组织（不透明）。去除幼虫其它组织部分，并把唾腺周围的白色脂肪剥离干净。组织部分，并把唾腺周围的白色脂肪剥离干净。唾液腺唾液腺 解剖针 解剖针 在低倍显微镜下，调节好光亮度观察，可见
7、一对半透明、隐约可见细胞界限的囊状物唾腺。移去虫体其余部份，用解剖针剔除附在唾腺一侧深色泡沫状的脂肪体，以保证制片质量。若载片上杂质较多，可用生理盐水适当冲洗，用吸水纸吸去多余的生理盐水。注意：在整个剥离过程中，不能让载片上的生理盐水干涸，否则唾腺收缩而不易剥离；冲洗残渣和吸去多余水液时，要避免唾腺被吸水纸吸走。3解离 将剥好的唾腺移到载片中央，加一滴1 mol/L HCl于腺体上，解离min，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体展开。4染色 用吸水纸吸去HCl，加1滴蒸馏水轻轻冲洗后，小心吸干。加12滴改良苯酚品红或其它染液，染色1015min。5压片压片 染色完成后，盖上干净的盖片，并覆
8、一层滤纸。将片染色完成后，盖上干净的盖片，并覆一层滤纸。将片子放在实验台上，用大拇指均匀用力压片。（注意不要使子放在实验台上，用大拇指均匀用力压片。（注意不要使盖片移动。）盖片移动。）注意：压片时适当多加些染液有利于染色体臂的伸展，但要防止染液过多而造成材料随染液而溢出。6镜检 在低倍镜选择唾腺细胞多且染色体分散好的视野，换高倍镜仔细观察唾腺染色体的染色中心、染色体臂和横纹以及可能有的疏松区、裴氏环、或因易位而形成的十字形图象和因倒位而形成的倒位环等各种结构。六六 注意事项注意事项 1.一定加生理盐水，否则唾腺易干。一定加生理盐水，否则唾腺易干。2.将脂肪组织清除干净。将脂肪组织清除干净。3.水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。水不可太多，否则幼虫会漂浮而且活跃。4.染色时间不可过长，否则背景也着色。染色时间不可过长，否则背景也着色。5.压片时要揉，用力要均匀。压片时要揉，用力要均匀。6.染色完以后，将旧的染色液吸去，加新的染色液，染色完以后，将旧的染色液吸去，加新的染色液，再压片。再压片。7.吸水时勿将唾腺一起吸走。吸水时勿将唾腺一起吸走。七七 作业作业 制效果较好的唾腺染色体临时片1张。绘出你所观察到的果蝇唾腺染色体略图，并仔细描绘各染色体臂末端条横纹。