1、动物布氏杆菌病血清学诊断动物布氏杆菌病血清学诊断 1887年英国军医Bruce首先从死于“马耳他热”的英国士兵的脾脏中分离出羊种布氏菌。布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌侵入机体，引起传染变态反应性的人畜共患传染病。布鲁氏菌病简称布病。布鲁氏菌简称为布氏菌 布鲁氏菌病布鲁氏菌病 适用范围适用范围 本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。本规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和
2、绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。布鲁氏菌病检验方法：依据标准布鲁氏菌病检验方法：依据标准GB/T18646-2002 布氏杆菌分离培养布氏杆菌分离培养 布菌培养：琼脂培养基、血琼脂培养基，厌氧培养。布菌鉴定：菌落形态观察、涂片、染色、镜检布氏菌，诊断血清凝集试验。试管增菌试管增菌 布氏菌特异的油滴样菌落布氏菌特异的油滴样菌落 图2血平皿 布氏菌菌落 图1琼脂布鲁氏菌菌落 布氏菌革兰染色镜检布氏菌革兰染色镜检 布病布病血清学血清学检验检验 1 2 布病虎红平板凝集实验布病虎红平板凝集实验 布病试管凝集实验布病试管凝集实验 布病虎红平板凝集实验布病虎红平板凝集实验 材料准备：材料准备：抗原、标准阳性
3、血清、阴性血清由青岛易邦生物科技公司提供，按说明用。受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。准备一块洁净玻璃板，画成若干个4厘米小格或虎红平板凝集试验玻璃板、陶瓷板。用移液器，适于滴加0.03ml（即300l）液体。原理：原理：利用酸性带色的抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，主要检查血清中的IgG类抗体。操作方法操作方法 在实验薄片上标记好位置滴加0.03ml的抗原。图1.在每一个标记好的布病抗原上滴加0.03ml的待检血清，用移液器吸头搅混均匀。每次试验应设阴性、阳性血清对照 图图1 1 判定结果前最好将抗原与血清混合物摇动几下.如图3.在阴性、阳性血清对
4、照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。被检血清在4分钟内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（）。每份被检血清在规定时间内出现凝集反应者判为阳性，不出现凝集为阴性反应。结果判定结果判定 阳性阳性 阴性阴性 注意事项注意事项 本抗原适合于大数量田间检疫和筛选诊断试验用。本试验出现阳性反应的动物，需经试管凝集试验或其它辅助试验方可定性。本抗原使用前应充分摇匀，方可使用。凡本抗原出现污染或摇不散的凝集块者不得使用。布鲁氏菌病试管凝集试验布鲁氏菌病试管凝集试验 原理：布氏菌侵入机体后，就会刺激机体产生特异性抗体，这种抗体可与相应的布氏菌抗原发生特异性结合，在电解
5、质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，也就是用已知抗原查未知抗体。稀释液：0.5%石碳酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，抗原的稀释亦用含0.5%石碳酸的10%盐溶液。1.2抗原、阳性血清、阴性血清由指标单位提供，按说明书使用。1.3 凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱等。三分是英制管道直径长度的叫法，换算成毫米为三分是英制管道直径长度的叫法，换算成毫米为9.525mm，这里指内径约为，这里指内径约为10mm试管试管 材料准备 1.按常规方法采血分离血清。2.运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内
6、不能送检，按每9ml血清加1ml5%石碳酸生理盐水防腐，也可冷藏方法运送血清。3.被检血清的稀释 以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。3.1 第1管标记检验编码后加1.15mL稀释液。3.2 第24管各加入0.5mL稀释液。3.3 然后向第1管内加入0.1mL被检血清，并混合均匀。充分混匀后弃去混合液0.25mL。操作方法 3.4 取0.5ml混合液加入第2管，混合均匀。3.5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5mL。3.6 稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100。3.7 牛、马、鹿、骆驼血清稀释
7、法与上述基本一致，差异是第1管加1.2mL稀释液和0.05mL被检血清。3.8 将0.5mL稀释好（具体稀释倍数参照试剂生产厂家的要求，一般是1：20）的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1:50、1:100、1:200和1:400。大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1：50和1：100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50。布鲁氏菌病试管凝集反应试验（羊、猪）布鲁氏菌病试管凝集反应试验（羊、猪）1号管 2 号管 3号管 4号管.n 0.5%石 炭酸 10%盐水
8、1.15 0.5 0.5 0.5.最后一最后一管弃去管弃去0.5ml 被 检 血 清或 阳 阴 性血清对照 加加0.1ml血清，血清，混匀后弃去混匀后弃去0.25ml最后最后体积为体积为1ml 0.5 0.5 0.5.试 管 中 加抗 原 以 前液体量 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 加抗原液加抗原液（1：10稀稀释好的释好的）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 血清稀血清稀 释度释度 1:25 1:50 1:100 1:200.充分混匀充分混匀371818-2424小时温育小时温育 结果 判定 +-吸0.5ml 布鲁氏菌病试管凝集反应试验（牛）1 2 3 4.n
9、0.5%石 炭酸 盐水 1.2 0.5 0.5 0.5.最后一管最后一管弃去弃去0.5ml 被 检 血 清或 阳 阴 性血清对照 加加0.05ml血清，混血清，混匀后弃去匀后弃去0.25ml最最后体积为后体积为1ml 0.5 0.5 0.5.试 管 中 加抗 原 以 前液体量 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 加抗原液加抗原液（1：10稀稀释好的释好的）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 血清稀血清稀 释度释度 1:50 1:100 1:200 1:400.充分混匀充分混匀371818-2424小时温育小时温育 结果 判定 +-吸0.5ml 比浊管的制备 +生理盐水（
10、ml）0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 稀释抗原（ml）1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 1.00 0.75 0.50 0.25 0.25 0.50 0.75 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 每次实验必须配制比浊管做为判定清亮程度的依据，配置方法如下：取本次实验用的抗原稀释液（抗原原液20倍稀释液）5-10ml，按有图比例配置。5 1 2 3 4 3.9 每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，a)阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与被检血清相同。b)阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与被检血清相同。c)抗原对照：
11、稀释好的抗原液0.5ml,再加0.5ml稀释液，观察抗原是否有自凝现象。3.10 将稀释好各管置3740温箱24小时，取出检查并记录结果。判定标准判定标准 1供判定参照比浊管制备方法略 2 结果判定 2.1凝集成度分为：参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读 菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮；菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮；菌体凝集显著，液体50%清亮；凝集物有沉淀，液体25%清亮；凝集物无沉淀，液体均匀混浊。2.2牛、马、鹿、骆驼1：100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1：50血清稀释，出现“”以上凝集现象时，被检血清判定为阳性。2.3牛、马、鹿、骆驼1：50血清稀释，猪
12、、山羊、绵羊、狗1：25血清稀释，出现“”以上凝集现象时，被检血清判定为可疑反应。可疑反应家畜经34周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。试管凝集试验结果 布病试管凝集阳性结果 试管凝集试验阳性结果试管凝集试验阳性结果（液体上层清亮，底部凝集）（液体上层清亮，底部凝集）布病试管凝集阴性结果 比浊管比浊管 试管凝集试验抗原对照试管凝集试验抗原对照（均匀的浑浊液体）（均匀的浑浊液体）注意事项注意事项 1、受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放时间不宜过长，采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。2、试管凝集实验用于布病诊断，做好个人防护。3、实验过程严格执行生物安全操作标准，防止病原传播。