1、免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清的制备 第一节免疫原的制备第一节免疫原的制备 免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质 一、颗粒性抗原的制备：1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。2.细菌抗原：H抗原 有动力的菌株 O抗原 100 2-2.5h 为了 破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原 3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射 二、可溶性抗原的制备：组织和细胞粗抗原的制备：1.组织和细胞混合抗原的制备：组织匀浆制备：标本要求：新鲜或低温（-40）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行 灌注，除去血管内残留血液 制备 处理好组织0.05NaN3生理
2、盐水洗净剪成小块 粉碎高速组织捣碎机法2000-3000rpm离心10min 研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨 上清 10000-20000rpm 20-30min高速离心 2.细胞抗原的制备：细胞抗原 细胞膜蛋白抗原 细胞浆抗原 细胞核及核膜抗原 粉碎：（1）反复冻融法 （2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸 （3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏 （4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系 需一定PH和温度动物组织cell 0-4 微生物 室温 （5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织cell （6）表面活
3、性剂处理法 蛋白质抗原的制备和纯化：可溶性抗原绝大部分为蛋白质 1.超速离心和梯度密度离心法：用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质 1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离 2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度 3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷 适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法 2.选择性沉淀法：用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀 1）核酸除去法：（1）提取沉淀剂：（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液作用3
4、0-60min（4），即可除去核酸 2）盐析沉淀法：（1）抗原的粗筛 33-50饱和度的硫酸铵 （2）提取丙种球蛋白 主要为IgG 33-40饱和度的硫酸铵 （3）抗原的浓缩 3）有机溶剂沉淀法：有机溶剂多为酒精和丙酮 4）水溶性非离子型聚合物沉淀法：PEG+蛋白质颗粒沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同pro3-4沉淀免疫复合物6-7沉淀IgM 8-12沉淀IgG 12-15%沉淀其他球蛋白 25沉淀白蛋白 3.凝胶过滤和离子交换层析：1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种 大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较
5、慢。根据分子量不同 2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素 流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同）常用于分离IgM 因为IgM分子量大 凝胶过滤洗脱曲线 4.亲和层析：利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物.1）亲和层析支持物的选择：常用：琼脂糖珠（Sepharose 2B、4B、6B）2）配体的选择：3）抗原或抗体与支持物的结合：步骤：（1）活化支持
6、物上的功能基因 溴化氛PH11 与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因 （2）交联（联接）（3）清洗：除去未结合的pro （4）亲和层析条件的选择：原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱
7、，从而得到纯化的Ab。2）配体的选择：抗原或抗体与支持物的结合：步骤：（1）活化支持物上的功能基团 溴化氰PH11 与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团 （2）交联（联接）（3）清洗：除去未结合的pro （4）亲和层析条件的选择：原理：在一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地 分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变
8、缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的Ab。以免疫亲和层析为例（三）免疫球蛋白片段的制备：1）温和 分离亚单位：（1）改变PH值 PH3或10，Ig亚单位自动解离 （2）利用强度性剂 适合载脂蛋白Ag和胶原肽的提取 2）二硫键的解离：适合于将轻、重链分开 3）溴化氰裂解法：与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯 4）酶法裂解：木瓜酶 将IgG分解为Fc和Fab（2）三个片段 胃蛋白酶 IgG分解为（Fab）2和几个小肽段 胰蛋白酶 IgG切成不规则肽链 应用：木瓜酶切断，得Fc段，制备抗重链血清 胃蛋白酶切取，得F
9、（ab）2，用于诊断（用Ab鉴别Ag）（四）纯化抗原的鉴定：1.含量鉴定：生化方法 酚试剂法 双缩脲法 可见光吸收法 紫外吸收法 Ag宝贵，少 2纯度的鉴定：醋酸纤维薄膜电泳法 经典常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 免疫电泳法 免疫双扩散法 ELISA或RIA（放免）不纯，也可能是同一物质的聚合体或降解物 较纯，也不能排除在这条带中有其他成分 所以单一方法，可信度差。因而几种方法联用较可靠 三、半抗原免疫原的制备 半抗原：只有反应原性，没有免疫原性的小分子物质 半抗原+载体大分子物质-Ab 人工抗原 结合方法 物理法：利用电荷和微孔 化学法（一）载体的选择：1.蛋白质：常用牛血清白蛋白 2.多肽类聚
10、合物：常用多聚赖aa 3.大分子的聚合物和某些颗粒：加入福氏佐剂可产生良好Ab（二）联接的方法：三个基本条件：1.碳化二亚胺法;2.二醛法：3.混合酸酐法（氯甲酸异丁酯法）三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备：1.琥珀酸酐法 2.O-（羧甲基）羟胺法 3.一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原 4.重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原 四.佐剂：（一）使用佐剂的目的为提高免疫原性 佐剂本身可有或无免疫原性（二）机理：1.可直接或参与cell免疫反应 2.佐剂与Ag混合，可以使Ag在局部组织的存留时间长，延长Ag的局部吸收。可持续刺激机体，产生高滴度Ab 3.佐剂可增加Ag表面积，并改变Ag的活
11、性基因构型，从而增加Ag的免疫原性。常用的佐剂和制备方法：1.应用最多的为福氏佐剂 不完全：石蜡油+羊毛脂 完全：石蜡油+羊毛脂+卡介苗 2.乳剂的制备：乳剂：Ag和佐剂的混合物 Ag与佐剂比例为1：1，注射前要充分乳化 乳化方法 研磨法 搅拌混合法 旋涡混合 抗体的制备 多克隆抗体的制备克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 第二节第二节 抗血清的制备抗血清的制备 免疫原+佐剂刺激动物机体获得抗血清 一.动物的选择 1.种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，甚至不产生 2.抗血清量的要求：量大，选大动物 量少，选小动物 3.抗血清的要求：R型（兔型）H型（马型）4.抗原的选择：
12、蛋白质Ag大部分动物皆适合，常用家兔、山羊 IgE对绵羊，胰岛素对家兔，酶对山羊免疫时不产生Ab 5.甾体激素多用兔，酶多用豚鼠 6.对动物个体的要求：雄性 稚龄、健康、正常、无感染 二、免疫前准备 1.正常饲养：3d，观察是否健康、正常、无感染 2.取阴性血清：耳静脉取血 二、免疫剂量、时间和途径选择原则：1.剂量：大动物0.5-1mg/只 小动物0.1-0.6mg/只 1）免疫剂量不要过大，Ag过量，易产生免疫抑制 2）第一次免疫剂量要小，多次免疫后可加大剂量 3）选择合适的免疫剂量，要根据Ag性强弱，分子量大 小，动物大小，免疫时间而定。2.时间：1）间隔时间短，易产生免疫抑制 一般第1
13、、2次间要有10-20d，2次以后7-10d 2）半抗原间隔时间长 3.途径：多点注射，（足掌、腋窝L结周围，背部两侧，颌下，耳 后皮内或皮下注射）Ag宝贵，采取微量注射法 免疫程序：1.背部皮下多点注射 2.淋巴结内注射 试血 1.根据免疫程序末次免疫，从耳静脉取血 分离血清 2.琼脂双扩散测效价 三.动物采血法：抗血清鉴定 采血前，禁食动物24h，防止血脂过高 末次免疫后，5-7d之内采血。否则抗血清效价 1.颈动脉放血法：适于兔、羊 2.心脏采血法：适于小动物 3.静脉多次采血清 免：耳中央V 100ML 羊：颈V 1500-2000ML 小鼠：断尾或摘除眼球2ML 抗血清分离，灭活56
14、30min 第三节第三节 抗血清的鉴定和保存抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定：免疫成功，Ab较纯，含有杂Ab 免疫不成功 1.特异性鉴定：免疫双扩散法 2.效价的鉴定：免疫双扩散法 Ab稀释法：不稀释 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Ag 1/32作为Ag效价 3.AgAb的亲和力的鉴定 Ag+Ab AgAb K值109-1011L/mol之间 K值大，AgAb结合力大 K值小，AgAb结合力小 二、抗血清其他鉴定方法：三、抗血清的保存：1.4无菌处理，防腐液体状态3-6月 2.-20-40度冰冻保存 5年小包装 3.干燥冰冻 5-10年 第四节第四节 抗血清中抗体的
15、纯化抗血清中抗体的纯化 目的：除去杂Ab 1.Ab特异性的纯化 除去杂Ab 1）吸附剂法 2）亲和层析 2.特异性IgG抗体的制备：1）盐析法粗提V球蛋白 不同饱和度的（NH4）2SO4或Na2SO4 2）离子交换层析法提取IgG：常用DEAE纤维素IgG带正电荷，其他pro带负电荷 3）亲和层析法提取特异性IgG 4）酶解法制备F（ab）2片段 第五节 单克隆抗体及基因工程抗体 一、单克隆抗体：1、淋巴细胞杂交瘤技术 2、单克隆抗体 3、单克隆与多克隆抗体比较 4、用途 二、基因工程抗体 一、单克隆抗体 1、淋巴细胞杂交瘤技术(kohler milstein)淋巴细胞杂交瘤技术：75年才创立
16、的技术，将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合产生杂交瘤细胞，所得杂交瘤细胞继承了两种细胞的能力，即保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力，又继承了免疫细胞合成与分化的能力，淋巴细胞主要 T细胞、B细胞(T细胞与胸腺瘤细胞融合，可产生分泌淋巴因子的T细胞杂交瘤)B细胞与 瘤细胞融合，产生能分泌特异抗体的B细胞杂交瘤。2、单克隆抗体：通过淋巴细胞杂交瘤技术，把产生特定抗体的B细胞与能无限生长的骨髓瘤的细胞融合，形成的B细胞杂交瘤，由这克隆化B的 杂交瘤所产生的抗体。纯度高，专一性强，重复性好，且能持续在动物体外或体内产生固体性抗体。3、单、多克隆抗体比较：多克隆抗体：是由多个淋巴细胞克隆产生的(抗原分子量大，表面决定簇多产生不 抗体)是高度异质性，特异性低，纯度差，反应不够灵敏，限制免疫学血清学的发展，影响诊断准确性和治疗效果。单克隆抗体：特异性强，体外 产生，质地均一，反应灵敏，工业化生产任何多肽蛋白质特别是半抗原均可用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体。4、单克隆抗体的应用：单克隆抗体技术被誉为免疫学的一次革命，是20世纪后20年内最为重要的