1、抗菌药物的敏感试验抗菌药物的敏感试验 张德纯 教授 病原生物学教研室 医院感染近年来已成为全球性的突出问题，其主要原因之一是抗菌药物的使用不当促进耐药菌在病人体内和医院环境中定植繁衍，进而导致的交叉感染和内源性感染日益增多。合理使用抗菌药物的前提之一是要重视感染病原学的实验室诊断和监控抗感染治疗的实验室服务。为临床抗感染治疗的药物选择以及疗效的监测和考核提供实验室依据是临床微生物实验室的重要职能之一。药物敏感试验包括体外抗菌药物敏感试验、体内抗菌药物活性的测定和药物浓度的测定。体外抗菌药物敏感试验包括抑菌试验、杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌产生的抗生素灭活酶。常用的体外抗菌药物敏感试验有纸片
2、扩散法、稀释法和E试验法。本章仅对临床微生物实验室常用的体外药敏试验的基本原理和方法进行介绍。一、临床常用的抗菌药物 抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。1.青霉素类抗生素 2.头孢菌素类抗生素 3.其他-内酰胺类抗生素 4.氨基糖甙类抗生素 5.喹诺酮类抗生素 6.大环内酯类抗生素 7.四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素 8.糖肽类抗生素 9.磺胺类药物及增效剂 10.其他合成抗菌药 二、抗菌药物敏感性试验（一）抗菌药物敏感性试验的意义 抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test,AST）意义在于：1.可预测抗菌治疗的效果，既AST
3、试验结果为“敏感”时，治疗可能有效；试验结果为“耐药”时，使用该药物治疗肯定失败；2.指导临床医生选择使用抗生素，AST的结果往往在给予病人经验性治疗2448h之后，若AST结果为“敏感”，该治疗为有效，若结果为“耐药”，即应更换药物；3.提供所选择药物的依据；4.监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病的流行病学，控制和预防耐药菌感染的发生和流行。（二）药敏试验方法 1 纸片扩散法 1）K-B纸片琼脂扩散法（1）原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌
4、的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。2.抗菌药物纸片：选择直径6.35mm的新华滤纸含药物纸片，-20保存。3.培养基：用水解酪蛋白（Mueller-Hinton MH）琼脂。琼脂厚度4mm。9cm内径的平板需倾注25-30ml琼脂，7cm内径的平板需倾注15 ml琼脂。对于营养要求高的细菌在MH琼脂基础上加入血清或血液。4.操作步骤：接种 在已分纯的待测菌平板上挑取45个菌落 35 46 h 35mlMH肉汤中 用肉汤调整菌液至 15min 内 0.5个麦氏管（1.51
5、08/ml）用无菌 棉签均匀涂布平板（涂布3次，每次旋转平板60 度，最后沿平板内缘涂抹1周）室温5分钟后 贴纸片（各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm）35 16-18h 观察结果 5.结果判断：量取抑菌圈直径 抗菌药物敏感性标准分为以下三级：敏感敏感：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。中度敏感中度敏感(中介中介)：指测试菌可被测定药物大剂量给药后在体内能达到的浓度所抑制，或在测定药物浓集部位的体液中，如尿中被抑制。耐药耐药：表示测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。6.影响因素（1）培养基的质量，如PH、深度、硬度
6、和表 面湿度等；（2）药敏纸片的质量，含药量和保存方式；（3）接种菌量正确与否是影响结果的重要因 素之一，取决于比浊标准的配制，正确使用和保存；（4）试验操作质量：接种细菌后贴片时515 分钟；（5）孵育条件，温度和时间：培养时间 1618h,不要超过24h。7.质量控制 采用标准菌株：金黄色葡萄球ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，和铜绿假单胞菌 ATCC27853 2）直接纸片药敏法 由确证感染部位采集到的一些重要临床标本直接涂布接种MH琼脂或5%羊血MH琼脂，然后放置药敏纸片。不仅可提早24h得出初步药敏结果供临床用药参考，还有助于发现混合感染中的不同菌种、耐药菌株以及病原
7、菌的鉴定。但由于此法难以控制接种菌量，且标本中可能存在多种细菌，因此还需要在病原菌分纯后再用KB法对其进行验证和补充。2 稀释法 1）肉汤稀释法 包括试管稀释法和微量稀释法。下面重点讲述试管稀释法（常量稀释法）。（1）.原理：以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。最 低 抑 菌 浓 度（minimal inhibitory concentration,MIC）：细菌生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对测试菌的MIC。最 低 杀 菌 浓 度（minimal bactericidal co
8、ncentration,MBC）：某 抗 菌 药 物 能 杀 灭99.9%以上测试菌时的最低药物浓度。试管编号：抗生素：2ml(512 g/ml)MH肉汤 抗生素含量 菌液(ml)：（1.5107/ml)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 256 128 64 32 16 8 4 2 1-不加抗生素 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml1ml(弃去)对倍稀释：(2)方法 注意:设立对照管(肉汤对照
9、管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管.（3）结果判断:不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC.如第六管不出现肉眼可见生长,则MIC=原药物浓度(512 g/ml)稀释倍数(1:32)=16 g/ml 将所有无菌生长的试管转移到血平板，培养过夜，平板上无菌落生长的最低药物浓度为药对该菌的MBC.混匀 35 1620h 观察结果 （4）影响因素：培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本试验的结果。（5）质量控制：每批或每次实验时应根据测试菌种类分别选用金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，粪肠球菌ATCC29212
10、和 铜 绿 假 单 胞 菌ATCC27853等标准菌株在同一试验条件下进行测定。2）琼脂稀释法（1）原理：将药物混匀于MH琼脂平板上，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含的药物浓度测 得MIC。（2）方法：将0.5麦氏管菌液稀释10倍以多头接种器接种于琼脂表面，稀释的菌液15min内接种完毕，置35孵育1620h。（3）质量控制：原则同肉汤稀释法，每个琼脂平板应同时接种标准菌株。3 E试验 E试验是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。（1）原理 E试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先
11、制备的，浓度呈连续指数增长的稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。（2）方法 菌液、平板接种等同纸片琼脂扩散法,待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。采用NCCLS2002 AST执行标准推荐孵育条件。（3）结果判读：读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。E试验 细菌生长区 抑菌圈 含药试条 最低抑菌浓度 4
12、联合药物敏感试验（1）联合药敏试验的方法 联合药敏试验的方法很多，其中纸片法最为常用。下面就介绍纸片法的试验方法。与纸片扩散法类似。先将试验菌均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，两纸片中心距离2-4mm左右。然后35 孵育过夜，取出观察结果。2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果：A.无关作用：甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用：甲+乙甲单或乙单 C.相加作用：甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用：甲+乙甲单+乙单 A.无关作用：甲+乙=甲单或乙单 细菌对两药均耐药 细菌对甲耐药对乙敏感 细菌对两药均敏感，抑菌环交界角尖锐。B.拮抗作用：甲+乙甲单或乙单 细菌对甲药耐药，对乙药敏感，甲药对乙药发生切割状拮抗现象。细菌对甲乙两药均敏感，乙药对甲药发生扇圆形拮抗现象。细菌对甲乙两药均敏感，甲乙两药发生相互切割状拮抗现象。C.相加作用：甲+乙=甲单+乙单 甲乙两药抑菌环交界角钝圆。D.协同作用：甲+乙甲单+乙单 甲乙两药抑菌环交界角平直 细菌对甲药不敏感，乙药抑菌环向甲药扩大。无抑菌作用的两药之间出现抑菌区。思考题：1.最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的含义与用途。2.常用药物敏感试验的方法、报告方式与影响因素。3.药物敏感试验有何临床意义？