1、1 燕 德 起 2 血清总胆红素和结合胆红素测定 改良改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红法测定血清总胆红素和结合胆红素素 胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素红素 3 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【原理原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠苯甲酸钠-醋酸钠醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法
2、重试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应氮反应pH6.5pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素紫色偶氮胆红素(吸收峰吸收峰530nm)530nm)转变成蓝转变成蓝色偶氮胆红素，在色偶氮胆红素，在600nm600nm波长比色，使检波长比色，使检测灵敏度提高。测灵敏度提高。4 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【试剂试剂】1咖啡因咖啡因-苯甲酸钠试剂苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠称取无水醋酸钠41.0g41.0g，苯甲酸钠，苯甲酸钠38.0g38.0g，乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠(EDTA(EDTA-Na2)0
3、.5gNa2)0.5g，溶于约，溶于约500ml500ml去离子水中，去离子水中，再加入咖啡因再加入咖啡因25.0g25.0g，搅拌使溶解，搅拌使溶解(加入咖啡因后不能加热溶解加入咖啡因后不能加热溶解)，用去离子水补足至用去离子水补足至1L,1L,混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。2 2碱性酒石酸钠溶液碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠称取氢氧化钠75.0g75.0g，酒石酸钠，酒石酸钠(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g，用去离子水溶解并补足至，用去离子水溶解并补足至1L1L，混匀。，混匀。置塑料瓶中，室温
4、保存。置塑料瓶中，室温保存。3 372.5mmol/L72.5mmol/L亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠称取亚硝酸钠5.0g5.0g，用去离子水溶解，用去离子水溶解并定容至并定容至100ml100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于3 3个个月。作月。作1010倍稀释成倍稀释成72.5mmol/L72.5mmol/L，冰箱保存，稳定期不少于，冰箱保存，稳定期不少于2 2周。周。4 428.9mmol/L28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸称取对氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g(NH2C
5、6H4SO3H?H2O)5.0g，溶于，溶于800ml800ml去离子水中，加入浓盐酸去离子水中，加入浓盐酸15ml15ml，用去离子水补足至，用去离子水补足至1L1L。5 5重氮试剂重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml0.5ml和对氨基苯磺酸溶和对氨基苯磺酸溶液液20ml20ml，混匀即成。，混匀即成。6 65.0g/L5.0g/L叠氮钠溶液。叠氮钠溶液。5 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素【试剂试剂】7 7胆红素标准液胆红素标准液 (1)(1)目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须目前一般用游非结合胆
6、红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清可用滤菌器过滤。取过滤后的血清1ml1ml，加入新鲜，加入新鲜0.154mmol/L 0.154mmol/L NaClNaCl溶液溶液24ml24ml，混合。在，混合。在414nm414nm波长，波长，1cm1cm光径，以光径，以0.154mmol/L 0.154mmol/L NaClNaCl溶液调零点，其吸光度应小于溶液调零
7、点，其吸光度应小于0.1000.100；在；在460nm460nm的吸光度应小的吸光度应小于于0.040.04。(2)(2)配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在在2525条件下，光径条件下，光径1.0001.0000.001cm0.001cm，波长，波长453nm453nm，摩尔吸光系，摩尔吸光系数应在数应在60 70060 7001 6001 600范围内；改良范围内；改良J J-G G法偶氮胆红素的摩尔吸光法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在系数应在74 38074 380866866。(3)(3)胆红素标准贮存液胆红素标
8、准贮存液(171mol/L)(171mol/L)准确称取符合要求的胆红准确称取符合要求的胆红素素10mg10mg，加入二甲亚砜，加入二甲亚砜1ml1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L0.05mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液2ml2ml，使胆红素完全溶解后，移入，使胆红素完全溶解后，移入100ml100ml容容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L0.1mol/L盐酸盐酸2ml2ml，边加边摇，边加边摇(勿用力摇动，以免产生气泡勿用力摇动，以免产生气泡)。最。最后以稀释
9、用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置包裹，置44冰箱冰箱3d3d内有效，但要求配后尽快作标准曲线。内有效，但要求配后尽快作标准曲线。6 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【操作步骤】混匀后，波长混匀后，波长600nm600nm，对照管调零，读取吸光度，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。7 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 标准曲线制作 混匀混匀(不可产生气泡不可产
10、生气泡)，按总胆红素测定法操作。，按总胆红素测定法操作。每一浓度作每一浓度作3 3个平行管，并分别做标准对照管，用各自个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线 8 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【参考范围参
11、考范围】血清总胆红素：血清总胆红素：5.15.119mol/L(0.319mol/L(0.31.1mg/dl)1.1mg/dl)；血清结合胆红素：血清结合胆红素：1.71.76.8mol/L(0.16.8mol/L(0.10.4mg/dl)0.4mg/dl)。【临床意义临床意义】1 1血清总胆红素测定的意义血清总胆红素测定的意义 (1)(1)有无黄疸及黄疸程度的鉴别。有无黄疸及黄疸程度的鉴别。(2)(2)肝细胞损害程度和预后的判断肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时
12、，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。(3)(3)新生儿溶血症新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。血清胆红素有助于了解疾病严重程度。(4)(4)再生障碍性贫血及数种继发性贫血再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢主要见于癌或慢性肾炎引起性肾炎引起)，血清总胆红素减少。，血清总胆红素减少。9 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【临床意义临床意义】2 2血清结合胆红素测定的意义血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。与总胆红素的比值可用于鉴
13、别黄疸类型。(1)(1)比值比值20%20%溶血性黄疸，阵发性血红溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。(2)(2)比值比值40%40%60%60%肝细胞性黄疸。肝细胞性黄疸。(3)(3)比值比值60%60%阻塞性黄疸。阻塞性黄疸。但以上几类黄疸，尤其是但以上几类黄疸，尤其是(2)(2)、(3)(3)类之间类之间有重叠。有重叠。10 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【注意事项注意事项】1 1胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。2 2轻度
14、溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定。血脂及脂溶色素对测定有干扰，白而干扰吸光度测定。血脂及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。应尽量取空腹血。3 3叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。不
15、呈色。4 4本法测定血清总胆红素，在本法测定血清总胆红素，在10103737条件下不受温度条件下不受温度变化的影响。呈色在变化的影响。呈色在2h2h内非常稳定。内非常稳定。11 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素 【注意事项注意事项】5 5标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。6 6胆红素大于胆红素大于342mol/L342mol/L的标本可减少标本用量，或用的标本可减少标本用量，或用0.154mmol
16、/L NaCl0.154mmol/L NaCl溶液稀释血清后重测。溶液稀释血清后重测。7 7结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。情况下，问题更复杂。12 改良改良J J-G G法测定血清总胆红素和结合胆红素法测定血清总胆红素和结合胆红素H H 【评价评价】1 1灵敏度和线性范围灵敏度和线性范围 本法摩尔吸光系数为本法摩尔吸光系数为74 38074 380，标本，标本中胆红素中胆红素17.1mol/L17.1mol/L时吸光度约时吸光度约0.08(0.08(血清