1、血清总胆红素及结血清总胆红素及结合胆红素测定合胆红素测定 重氮反应法测重氮反应法测定总胆红素和结合定总胆红素和结合胆红素胆红素 【实验原理实验原理】血清中结合胆红素可直接与重氮试血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因素须有加速剂咖啡因-苯甲酸钠苯甲酸钠-醋酸钠醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应氮反应pH6.5pH6.5，最后加入碱性酒石酸钠使，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素紫色偶氮胆红素(吸收峰吸收
2、峰530nm)530nm)转变成蓝转变成蓝色偶氮胆红素，在色偶氮胆红素，在600nm600nm波长比色，使检波长比色，使检测灵敏度提高。测灵敏度提高。【检验原理检验原理】总胆红素在总胆红素在pH3.0附近，在钒附近，在钒酸盐和表面活性剂存在下，可以被酸盐和表面活性剂存在下，可以被氧化成胆绿素。与此同时，胆红素氧化成胆绿素。与此同时，胆红素特有的黄色也随之消失。测定胆红特有的黄色也随之消失。测定胆红素氧化前后吸光度的差，可以计算素氧化前后吸光度的差，可以计算出样品中总胆红素的浓度。出样品中总胆红素的浓度。【试剂试剂】1咖啡因咖啡因-苯甲酸钠试剂苯甲酸钠试剂 2 2碱性酒石酸钠溶液碱性酒石酸钠溶液
3、 3 372.5mmol/L72.5mmol/L亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液 4 428.9mmol/L28.9mmol/L对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液 5 5重氮试剂重氮试剂 6 65.0g/L5.0g/L叠氮钠溶液。叠氮钠溶液。7 7胆红素标准液胆红素标准液 【操作步骤操作步骤】1.样品的测定样品的测定 取取3支试管，按下表程序操作支试管，按下表程序操作.混匀后，波长混匀后，波长600nm600nm，对照管调零，读取，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。2.标准曲线制作标准曲线制作 取5支试管，分别编号，然后按表稀释胆红素储存
4、液配制胆红素标准液。混匀混匀(不可产生气泡不可产生气泡)，按总胆红素测，按总胆红素测定法操作。每一浓度作定法操作。每一浓度作3 3个平行管，并个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线曲线 【参考范围参考范围】血清总胆红素：血清总胆红素：5.
5、15.119mol/L(0.319mol/L(0.31.1mg/dl)1.1mg/dl)；血清结合胆红素：血清结合胆红素：1.71.76.8mol/L(0.16.8mol/L(0.10.4mg/dl)0.4mg/dl)。【临床意义临床意义】1 1血清总胆红素测定的意义血清总胆红素测定的意义 (1)(1)有无黄疸及黄疸程度的鉴别。有无黄疸及黄疸程度的鉴别。(2)(2)肝细胞损害程度和预后的判断肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高
6、。时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。(3)(3)新生儿溶血症新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。血清胆红素有助于了解疾病严重程度。(4)(4)再生障碍性贫血及数种继发性贫血再生障碍性贫血及数种继发性贫血(主要见于癌或慢主要见于癌或慢性肾炎引起性肾炎引起)，血清总胆红素减少。，血清总胆红素减少。2 2血清结合胆红素测定的意义血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。(1)(1)比值比值20%20%溶血性黄疸，阵发性血红溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。蛋白尿，恶性贫血，红细胞增
7、多症等。(2)(2)比值比值40%40%60%60%肝细胞性黄疸。肝细胞性黄疸。(3)(3)比值比值60%60%阻塞性黄疸。阻塞性黄疸。但以上几类黄疸，尤其是但以上几类黄疸，尤其是(2)(2)、(3)(3)类之间类之间有重叠。有重叠。【临床意义临床意义】doing 胆红素氧化酶法测胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆定总胆红素和结合胆红素红素 【原理原理】胆红素呈黄色，在胆红素呈黄色，在450nm附近有最大吸收峰。胆红素附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶氧化酶(BOD)催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，A450nm下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。下降，下降程度
8、与胆红素被氧化的量相关。在在pH8.0条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测化，因而检测450nm吸光度的下降值可反映总胆红素吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入含量；加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。其氧化。在在pH3.74.5缓冲液中，缓冲液中，BOD催化单葡萄糖醛酸胆红催化单葡萄糖醛酸胆红素素(mBc)、双葡萄糖醛酸胆红素、双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分及大部分胆红胆红素氧化，非结合胆红素素氧化，非结合胆红素(Bu)在此在此pH条件下不被氧化。条件下不被氧化。用配制于人血清中的二牛磺
9、酸胆红素用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin，DTB)作标准品，检测此条件下作标准品，检测此条件下450nm吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。【试剂】1 10.1mol/LTris0.1mol/LTris-HClHCl缓冲液缓冲液(pH8.2)(pH8.2)称取三羟甲基氨基甲烷称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g(Tris)1.211g，胆酸钠，胆酸钠172.3mg,172.3mg,十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg(SDS)432.6mg，溶于，溶于去离子水去离子水90ml90ml中，在室温中，
10、在室温(25(2530)30)用用1mol/L1mol/L盐酸调节盐酸调节pHpH至至8.2(8.2(约用约用6ml)6ml)，再加蒸馏水至，再加蒸馏水至100ml100ml，置冰箱保存，此液含，置冰箱保存，此液含4mmol/L4mmol/L胆酸钠、胆酸钠、15mmol/L SDS15mmol/L SDS。2 20.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pH4.5)(pH4.5)。3 3BODBOD溶液溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长过长(约可保存约可保存1 1周周)，如系液体，如系液体(可能含有甘油
11、可能含有甘油)，置，置44冰箱可保存较冰箱可保存较长时间，长时间，BODBOD贮存溶液的酶活性一般在数千至贮存溶液的酶活性一般在数千至1 1万万2 2万万U/LU/L，BODBOD工作工作液酶活性可按反应液中液酶活性可按反应液中BODBOD终浓度达终浓度达0.30.31.0U/ml1.0U/ml计算。计算。4 4总胆红素标准液总胆红素标准液(342mol/L)(342mol/L)按胆红素测定按胆红素测定J J-G G法中方法配制，或法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。市售合乎要求的标准液。5 5结合胆红素标准液结合胆红素标准液 将将DTBDTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，配于胆红素浓
12、度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，7070保保存，可稳定存，可稳定6 6个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定1 1年。年。【操作步骤操作步骤】总胆红素和结合胆红素测定分别按表标准管进行。取总胆红素和结合胆红素测定分别按表标准管进行。取4支试支试管，标明标准空白管，测定空白管，标准管和测定管。管，标明标准空白管，测定空白管，标准管和测定管。加入加入BOD工作液后立即混匀，置工作液后立即混匀，置37C水浴水浴5min，用分光光度计，在用分光光度计，在450nm波长，去离子水调零，波长，去离子水调零，读取各管吸光度读取各管吸光度(A)。用于对照管的比色杯与非。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。对照管的比色杯不得混用。谢谢谢谢