1、2003年年4月月14日宣布人类基因组序列图完成日宣布人类基因组序列图完成 这标志着进入了后基因组时代。这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指人类基因组：指DNA分子所携带的全部分子所携带的全部 遗传信息。遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究总和。主要是对蛋白质功能的研究 蛋白质分离的原理：蛋白质分离的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力亲和力等
2、等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的的蛋白质。蛋白质。一、基础知识一、基础知识 （一）（一）凝胶色谱法凝胶色谱法 2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有许多贯内部有许多贯穿的通道穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。分离。1.概念：（分配色谱法分配色谱法）3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程 4.凝胶色谱法的原理 相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部相对
3、分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢的通道，路程较长，移动速度较慢;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。进行体外实验时，如何保证蛋白质不进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？会发生变性呢？（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。1
4、.1.作用作用:2.2.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的中配制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范围内范围内使用的缓冲液。使用的缓冲液。3 3.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？（三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.
5、2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离中各种分子的
6、分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,NN,N-亚甲基双丙烯亚甲基双丙烯酰胺在酰胺在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的具的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交
7、联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。1.1.原理：原理：SDSSDS能使蛋白质发生完全变性能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成。由几条肽链组成的蛋白质复合体在的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各能与各种蛋白质形成种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSS
8、DS所带负电荷所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量原有的电荷量。因而掩。因而掩盖了盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。全取决于分子的大小。2.SDS2.SDS作用机理作用机理:用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准
9、蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。售。二、实验操作二、实验操作 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤 血血液液 血浆血浆 水水 分分 固体物质：固体物质：血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细血细 胞胞 白细胞白细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 （最多）（最多）血红蛋白血红蛋白 （9090）两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽
10、链 四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团 血液有哪些成分？血液有哪些成分？（一）血红蛋白（一）血红蛋白 血红蛋白血红蛋白 两个两个肽链肽链 两个两个一肽链一肽链 四个亚铁四个亚铁血血红素基团红素基团 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团，基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧一分子氧或一分子二氧化碳，或一分子二氧化碳，血红蛋白血红蛋白因含有因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、牛、羊的红细胞提，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红
11、细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤操作：洗涤操作：1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）细胞和淋巴细胞等一同沉
12、淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯的氯化钠溶液洗涤。化钠溶液洗涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。表明洗涤干净。1.1.样品处理及粗分离样品处理及粗分离 （二）操作过程（二）操作过程 (2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加：加蒸馏水到原血液体积，再加4040体积的甲苯体积的甲苯 ，置于
13、磁力搅拌器上充分搅拌，置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分分钟（加速细胞破裂）钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。(3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；第第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色层（
14、中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；第第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。(4)(4)透透 析：析：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。
15、小时。透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意注意事项事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致
16、液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：。组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择凝胶的选择：A A、材料：交联葡聚糖凝胶（、材料：交联葡聚糖凝胶（G G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱、装填：将凝胶悬