1、实验五、细菌的芽孢染色法实验五、细菌的芽孢染色法 1 一、实验的目的要求一、实验的目的要求 2 学习并掌握芽孢染色法学习并掌握芽孢染色法 初步了解芽孢杆菌的形态特征初步了解芽孢杆菌的形态特征 二、实验原理二、实验原理 芽孢又芽孢又称内生孢子，能否形成芽孢及芽孢的形状、芽孢在孢囊的位置、称内生孢子，能否形成芽孢及芽孢的形状、芽孢在孢囊的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。芽孢壁芽孢壁厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而厚，透性低，不易着色，一般染色法只能使菌体着色而芽孢不芽孢不着色（着色（芽孢呈芽孢呈无色透明状），而一旦染上色后又
2、难以脱色。无色透明状），而一旦染上色后又难以脱色。芽孢染色法芽孢染色法根据根据芽孢特点芽孢特点设计，除了用着色力强的染料外，还需要加设计，除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进热，以促进芽孢着色芽孢着色。当。当染芽孢时染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，菌体也会着色，然后水洗，芽孢，芽孢染上染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体复染，使菌体和芽孢呈现和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，出芽孢，便于观察。便于观察。细菌芽孢的基本构造细菌芽孢的基本构造 4 孢外
3、壁孢外壁 芽孢衣芽孢衣 皮层皮层 芽孢壁芽孢壁 芽孢质膜芽孢质膜 芽孢质芽孢质 芽孢核区芽孢核区 芽孢具有多层厚而芽孢具有多层厚而致密的胞膜，由内向致密的胞膜，由内向外依次为核心、内膜、外依次为核心、内膜、芽孢壁、皮质、外膜、芽孢壁、皮质、外膜、芽孢壳和芽孢外衣芽孢壳和芽孢外衣.细菌芽孢的基本特性细菌芽孢的基本特性 5 形成芽孢需要一定的外界条件，这些条件因菌种而异。形成芽孢需要一定的外界条件，这些条件因菌种而异。炭疽芽孢杆菌在有氧炭疽芽孢杆菌在有氧(O(O2 2)条件下才能形成芽孢，而破条件下才能形成芽孢，而破伤风芽孢杆菌则在无氧条件下形成芽孢。通常细菌在伤风芽孢杆菌则在无氧条件下形成芽孢。
4、通常细菌在营养不足时形成芽孢，但苏云金芽孢杆菌是例外。营养不足时形成芽孢，但苏云金芽孢杆菌是例外。细菌芽孢的基本特性细菌芽孢的基本特性 6 芽孢对恶劣环境条件有很强的抵抗能力，尤其耐高温。芽孢对恶劣环境条件有很强的抵抗能力，尤其耐高温。有的芽孢可耐有的芽孢可耐100100沸水煮沸数小时。在一定条件下，沸水煮沸数小时。在一定条件下，芽孢保持活力数年至数十年之久。高温灭菌的判断标芽孢保持活力数年至数十年之久。高温灭菌的判断标准就是细菌的芽孢是否被杀灭。准就是细菌的芽孢是否被杀灭。细菌芽孢的基本特性细菌芽孢的基本特性 7 芽孢在适宜条件下，营养物如葡萄糖、乳酸和水分，芽孢在适宜条件下，营养物如葡萄糖
5、、乳酸和水分，会发芽形成菌体，但细菌的数量并未增加，所以芽孢会发芽形成菌体，但细菌的数量并未增加，所以芽孢不是一种繁殖方式。不是一种繁殖方式。芽孢抵抗力强的原因芽孢抵抗力强的原因 8 1.1.芽孢含水量少，蛋白质受热后不易变性；芽孢含水量少，蛋白质受热后不易变性；2.2.芽孢具有多层致密的厚膜，理化因素不易透入；芽孢具有多层致密的厚膜，理化因素不易透入；3.3.芽孢中含有一种特有的化学组分吡啶二羧酸芽孢中含有一种特有的化学组分吡啶二羧酸（DPADPA），），DPADPA与钙结合生成的钙盐能提高芽孢中各与钙结合生成的钙盐能提高芽孢中各种酶的热稳定性。种酶的热稳定性。三、实验器材三、实验器材 1.
6、菌种：枯草芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌。2.染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液 3.仪器、材料：二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。四、实验方法（四、实验方法（SchaefferFulton氏染色法）氏染色法）1.制片：常规方法涂片、干燥、固定。2.染色：(1)涂片上滴加35滴5%孔雀绿水溶液。(2)用试管夹夹住载玻片一端，微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，计时5min。加热过程中切勿使染料蒸干，及时补加染液。待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(3)0.5%碱性番红复染2min，水洗。(4)制片干燥后油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色 五、实验报告 绘图标识枯草芽孢杆菌及芽孢形态，芽孢的着生位置。六、思考题 1为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?2试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。