1、第三章第三章 动物细胞与组织培养技术动物细胞与组织培养技术 第一节第一节 概述概述 一、动物细胞与组织培养的基本概念一、动物细胞与组织培养的基本概念 二、动物细胞体外培养的特点二、动物细胞体外培养的特点 三、发展历史三、发展历史 四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件(掌握）掌握）五、体外培养细胞生物学特性五、体外培养细胞生物学特性(掌握）掌握）第二节第二节 动物细胞、组织培养的基本方法动物细胞、组织培养的基本方法(掌握）掌握）第三节第三节 培养细胞的检测和特性鉴定培养细胞的检测和特性鉴定(掌握）掌握）第四节第四节 动物细胞体外培养举例动物细胞体外培养举例 第五节第五节
2、细胞同步化（了解）细胞同步化（了解）第六节第六节 组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）第一节第一节 概述概述 一、基本概念一、基本概念 1动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture)：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。是动物细胞工程的基础。分类：细胞
3、培养 组织培养 器官培养 2 2、原代培养、原代培养(Primary Culture)(Primary Culture)：亦称初代培养，指直接从亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。机体取出的细胞或组织进行培养的过程。3 3继代培养（继代培养（Secondary CultureSecondary Culture ）：亦称传代培：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4 4、细胞系细胞系(cell line)(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生
4、存的化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。5 5、细胞株、细胞株(cell strain)(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。法而得的单一类型的细胞群体。有限细胞系有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的细胞株。不能连续培养的细胞株。无限细胞系无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细胞株，能够连续培养的细胞株，也称无限系。也称无限系。无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的无限系细胞大多已发生
5、异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞。可能已成为恶性细胞。细胞株、细胞系的命名：细胞株、细胞系的命名：以组织来源定名，如以组织来源定名，如BHK(BHK(幼地鼠肾细胞幼地鼠肾细胞)以人名定名，如以人名定名，如HeLaHeLa细胞细胞 以时间地点来定名，如以时间地点来定名，如S7811S7811细胞系细胞系 以临床疾病类型定名，如以临床疾病类型定名，如BALLBALL-1 1细胞系细胞系(来自来自B B淋巴细胞急性白血病人白细胞淋巴细胞急性白血病人白细胞)用于生产的用于生产的动物细胞株动物细胞株 原代细胞原代细胞 二倍体细胞二倍体细胞 融合细胞融合细胞 基因工程细胞基因工程细胞 转化细胞
6、转化细胞 常用细胞株：常用细胞株：CHO细胞、细胞、Vero细胞、细胞、BHK-21细胞、细胞、WI-38细胞细胞 二、动物细胞体外培养特点二、动物细胞体外培养特点 动物细胞动物细胞生长缓慢生长缓慢，培养时间长。，培养时间长。更易受微生物污染更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体），（包括细菌、真菌、病毒、支原体），需要需要防治污染问题防治污染问题。对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括PHPH值、温值、温度、剪切力度、剪切力 对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般
7、还需要血清。乳糖外，一般还需要血清。原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代左右退化死亡。代左右退化死亡。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。平滑肌细胞平滑肌细胞 神经元细胞神经元细胞 血红细胞血红细胞 形态上表现为形态上表现为多种多样，如多种多样，如圆形、椭圆形圆形、椭圆形、正方形、柱、正方形、柱形、扁平形、形、扁平形、梭形、星形和梭形、星形和多边形等多边形等 三、动物细胞培养的发展历史三、动物细胞培养的发展历史 1885年，年，Wilhelm Roux（劳斯，德国）最先尝试离体培（劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活
8、了一段时间。并且，他首次采用了“组养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了“组织培养”一词。织培养”一词。1907年，美国胚胎学家年，美国胚胎学家Ross Harrison（哈里森）培养蛙（哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。1912年年,法国学者法国学者Alexis Carrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。在技术方面，卡雷尔把
9、无菌操作技术引入组织培养中。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。1923年，他设计了卡氏培养瓶。年，他设计了卡氏培养瓶。1913年，年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。建立了单盖片悬滴培养法。1925年，年，Maximow采用双盖片法。采用双盖片法。1934年，年，Gey和和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。了多种类型的培养瓶。1948年，年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。创建了单个细胞培养方法。1
10、951年，年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究 1951年，年，厄尔厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。基。1952年年Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌颈癌Hela细胞系。细胞系。1960年，年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。培养物中发现有自发的融合细胞。1962年
11、，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件 1、恒定的温度恒定的温度:37 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。响，甚至死亡。培养细
12、胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；人体细胞在人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；复可能；当温度在当温度在43以上以上1小时，细胞全部死亡。小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低温
13、下会使细胞代谢速率降低低 2、pH：最适为：最适为7.27.4 大多数细胞的适宜大多数细胞的适宜pH为为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境在偏酸环境中更利于细胞生长中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如如成纤维细胞最适合成纤维细胞最适合pH是是7.4-7.6，每种细胞都有其最适，每种细胞都有其最适pH值值.当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的生长会受到影响，甚至死亡。时的生长会受到影响，甚至死亡。3、气体气
14、体 气体：需要气体：需要O2、CO2（95%空气、空气、5%CO2）气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要所需气体主要有氧气和二氧化碳有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时开放培养时一般把细胞置于一般把细胞置于95%空气加空气加5%二氧化碳混合气体环境中二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分也是细胞生长繁殖所需成分,它它在细胞培养中的主要作用在
15、于维持培养基的在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值值.4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。酶、核酸、激素、生长因子等。5、无菌、无菌 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环
16、境无污染、代谢物及时清除等，是维持存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。细胞生存的基本条件。（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 （二）（二）培养细胞的生长特点培养细胞的生长特点（三）（三）培养细胞的生长与增殖过程培养细胞的生长与增殖过程 五、五、动物细胞的体外培养生物学特性动物细胞的体外培养生物学特性 贴壁依赖型细胞贴壁依赖型细胞 非贴壁依赖型非贴壁依赖型 成纤维细胞成纤维细胞 上皮型细胞上皮型细胞 游走型细胞游走型细胞 多形型细胞多形型细胞（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 于悬浮状态下于悬浮状态下即可生长即可生长 贴附于支持物表面贴附于支持物表面才能生长的细胞才能生长的细胞 1、贴壁依赖型细胞、贴壁依赖型细胞 含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。基质结合。单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。生长。在体外按照培养