1、细胞因子及免疫细胞功能检细胞因子及免疫细胞功能检测方法简介测方法简介 刘素侠刘素侠 山东大学医学院免疫学研究所山东大学医学院免疫学研究所 2011-2-23 内内 容容 细胞因子检测的常用方法细胞因子检测的常用方法 免疫细胞功能的常用检测方法免疫细胞功能的常用检测方法 一、免疫学检测的基本原理一、免疫学检测的基本原理 抗原与抗体反应的抗原与抗体反应的特异性特异性是各种免疫学检是各种免疫学检测技术的基本原理测技术的基本原理 二、细胞因子检测方法二、细胞因子检测方法 细胞因子的临床意义细胞因子的临床意义 常规测定法常规测定法 胞内细胞因子检测方法胞内细胞因子检测方法 细胞因子检测的主要临床应用细胞
2、因子检测的主要临床应用 （一）细胞因子的临床意义细胞因子的临床意义 细胞因子与疾病细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现为态下细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。加等。细胞因子与治疗细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：应答调节剂。已批准生产：IFNIFN-、，EpoEpo，GMGM
3、-CSFCSF，G G-CSFCSF，ILIL-2 2，正在进，正在进行临床试验的：行临床试验的：ILIL-1 1、3 3、4 4、6 6、1111，M M-CSFCSF，SCFSCF，TGFTGF-等等 （二）常规检测方法（二）常规检测方法 分子生物学测定法分子生物学测定法 生物活性检测法生物活性检测法 免疫化学测定法免疫化学测定法 1.1.分子生物学测定法分子生物学测定法 是测定细胞因子是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要的表达水平，主要有两种方法：有两种方法：分子杂交技术分子杂交技术 多聚酶链反应技术（多聚酶链反应技术（PCR）分子杂交技术分子杂交技术 制备细胞因子的基因探针；制备细胞
4、因子的基因探针；Northern 杂交或细胞原位杂交；杂交或细胞原位杂交；优点：高度敏感和高度特异；优点：高度敏感和高度特异；缺点：操作较繁琐缺点：操作较繁琐 测定结果只能代表细胞因子基因的测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。表达，而不能代表活性细胞因子的水平。多聚酶链反应技术（多聚酶链反应技术（PCR）PCR（polymerase chain reaction)技术，是一技术，是一种高效的基因体外扩增技术；种高效的基因体外扩增技术；将细胞因子产生细胞的将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转提取出来，再经逆转录合成录合成cDNA，以，以cDNA为模板，在细胞
5、因子引物为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行的引导下，即可进行PCR扩增；扩增；优点：灵敏度高优点：灵敏度高 操作简便操作简便 缺点：缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。而不能代表活性细胞因子的水平。PCR原理原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：dsDNA ssDNA 退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对 延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合
6、成一条新DNA 链 新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍 5 3 5 3 变性变性 退火退火 延伸延伸 第二循环第二循环 dsDNA ssDNA 加入引物加入引物 5 3 3 5 dNTP,Taq酶酶 5 3 5 5 3 3 3 5 5 3 5 5 反转录反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR)RT PCR RT-PCR反应过程反应过程 反转录PCR：mRNA-cDNA-PCR 抽提RNA 反转录合成cDNA PCR 扩增 RT反应体系反应体系 模板：总RNA，mRNA 引物：随机引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP)
7、逆转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase PCR反应体系 模板：逆转录产物cDNA 目的基因特异性引物；反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg+RT-PCR反应产物检测反应产物检测 凝胶电泳分析凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变 核酸序列分析（测序核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR(Fluorescence Quantified real time PCR)与常规与常规PCR相比，它具有特异性更强
8、、有效相比，它具有特异性更强、有效解决解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。目前已得到广泛应用。（1）原理原理 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术是指在技术是指在PCR反反应体系中加入荧光基团，利用荧光信应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个号积累实时监测整个PCR进程，最后进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。析的方法。1)常用名词概念常用名词概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 扩增曲线扩增曲线 设定荧光域值设定荧光域值 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；荧光域值的设
9、置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 3-15 意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入指数期的最初阶段；真正荧光信号：荧光信号大于阈值 荧光阈值荧光阈值（threshold）Ct值值 Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数 C代表Cycle（循环数）t代表threshold （荧光域值）Ct值的确定值的确定 横坐标：PCR循环数 纵坐标：荧光信号强 度 黑线：荧光域值 红线：无模板 -域值下一 直线 绿线：样品 Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）Ct值与起始模板的关系值与起始
10、模板的关系 研究表明，每个模研究表明，每个模板的板的Ct值与该模板的值与该模板的起始拷贝数的对数存起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷在线性关系，起始拷贝数越多，贝数越多，Ct值越小值越小。利用已知起始拷贝利用已知起始拷贝数的标准品可作出标数的标准品可作出标准曲线准曲线（2）常用标记方法）常用标记方法 非特异性荧光标记：SYBR Green I 特异性荧光标记：TaqMan Probe；分子信标 SYBR Green I染料法染料法 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBR Green I染料法原理染料法原理 注意事项注意事项 因为SY
11、BR Green I可以与所有dsDNA结合而激发荧光，因此，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体，也可以同时被检测，将导致结果不准确；关键：设计特异性引物关键：设计特异性引物！结果判定结果判定融解曲线融解曲线 （3）qPCR结果分析结果分析 相对定量解析相对定量解析 1 1）相对定量的必要性）相对定量的必要性 必须用内对照基因（管家基因）进必须用内对照基因（管家基因）进行校正行校正 2 2）管家基因筛选）管家基因筛选 管家基因：维持细胞生命活动代谢所必须的基因，如GAPDH,beta-Actin,18s rRNA等；筛选方法：根据文献提供；通过具体实验。3 3）分析方法）分析方法 双标准
12、曲线法 2-Ct法（Ct值比较法）1 1）双标准曲线法）双标准曲线法 通过标准曲线对对照样品、待测样品目的基因及管家基因进行定量，然后根据公式计算相对值，即为相对表达量。公式：校正值 目的基因定量结果 管家基因定量结果 相对值 待测样品校正值 对照样品校正值=校正值=目的基因定量结果 校正值=管家基因定量结果 目的基因定量结果 校正值=对照样品校正值 待测样品校正值 对照样品校正值=待测样品校正值 对照样品校正值 相对值=待测样品校正值 对照样品校正值 优缺点优缺点 优点：分析简单，实验优化相对简单；优点：分析简单，实验优化相对简单；缺点：对每一个基因，每一轮实验均需要缺点：对每一个基因，每一
13、轮实验均需要做标准曲线；做标准曲线；应用：基因表达调控研究应用：基因表达调控研究 2 2）2-Ct法法 2-Ct法：假设目的基因、对照基因扩增效假设目的基因、对照基因扩增效率均是率均是100%Ct（处理前/对照组）=18-17=1 Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4 Ct=Ct（处理后）-Ct（处理前)=-2.4 比率（处理后/处理前）=2-Ct=2-2.4=5.3 结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍 修正：扩增效率不是1，而是E，2-Ct可修正为（1+E）-Ct 优点优点 特异性好；简单、安全、自动化程度高；速度快、高通量；线性关系好、线性范围宽 2.生物活性检测法生
14、物活性检测法 测定细胞因子的生物学活性：刺激细胞增殖、维持细胞生长和存活、抑制细胞生长、溶解或杀灭细胞、抗病毒、促进细胞趋化、刺激细胞生成集落等活性；指示细胞：多选用造血系统或淋巴系统细胞，最好用依赖性细胞株细胞；显示细胞反应：用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。（1）依赖性细胞株）依赖性细胞株 一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的细胞因子；优点：敏感性高，特异性强；缺点：应用有限。（2）功能检测）功能检测 利用一
15、些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。优点：敏感性高；缺点：特异性不够，容易受一些扰因素的影响。A.增殖或增殖抑制法增殖或增殖抑制法 其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，通过3H-TdR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。B.集落形成法集落形成法 其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。C.直
16、接杀伤靶细胞直接杀伤靶细胞 细胞因子TNF-、TNF-具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以WEHI164亚克隆13（鼠纤维肉瘤细胞系）作为指示细胞，通过3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。D.抗病毒效应抗病毒效应 靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击；常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV），敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-、IFN-、IFN-）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。E.趋化作用趋化作用 IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。F.抗体形成法抗体形成法 IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白；指示细胞：分泌IgG的ARH-77、CESS 分泌IgM的SKW6.CL-4 方法：在一定条件下，待检样品中IL-6水平与培