1、显微镜细胞计数法显微镜细胞计数法 血细胞计数仪计数法血细胞计数仪计数法 直接计数法直接计数法 间接计数法间接计数法（比值计数法）（比值计数法）将标本作适当稀释将标本作适当稀释(或浓缩或浓缩)后直接在显后直接在显微镜下计数一定容积内的细胞，经换算微镜下计数一定容积内的细胞，经换算可知单位体积标本中的细胞数。可知单位体积标本中的细胞数。一、原理一、原理 二、应用二、应用 常用于常用于血细胞计数、尿沉渣定量分析、血细胞计数、尿沉渣定量分析、脑脊液细胞计数、浆膜腔积液细胞计数、脑脊液细胞计数、浆膜腔积液细胞计数、精子计数精子计数等。等。1.1.显微镜显微镜 三三.器材器材 2.2.微量吸管微量吸管 3
2、.3.计数板：改良计数板：改良NeubauerNeubauer计数板计数板 2 原红原红 早幼红早幼红 中幼红中幼红 晚幼红晚幼红 网织红网织红 红细胞红细胞 骨髓造血干细胞骨髓造血干细胞 EpoEpo 红系祖细胞红系祖细胞 erythrocyte red blood cell 用用等渗稀释液等渗稀释液将血液稀释一定倍数，充将血液稀释一定倍数，充入计数池中，于显微镜下计数一定体积入计数池中，于显微镜下计数一定体积内的红细胞数，经过换算求得每升血液内的红细胞数，经过换算求得每升血液中的红细胞数量。中的红细胞数量。一一.原理原理(red blood cell count,RBC)1.1.显微镜显微
3、镜 二二.器材器材 2.2.微量吸管微量吸管 3.3.计数板：改良计数板：改良NeubauerNeubauer计数板计数板 氯化钠氯化钠 1.01.0g g 结晶硫酸钠结晶硫酸钠 5.05.0g g 氯化高汞氯化高汞 0.50.5g g 蒸馏水蒸馏水 加至加至200200mlml 三三.试剂试剂 赫姆氏（赫姆氏（HayemHayem）红细胞稀释液红细胞稀释液 氯化钠：调节渗透压氯化钠：调节渗透压 硫酸钠：提高比密，防止红细胞粘连。硫酸钠：提高比密，防止红细胞粘连。氯化高汞：防腐剂氯化高汞：防腐剂(RBC)四四.方法方法 1.1.小试管加小试管加RBCRBC稀释液稀释液1.991.99mlml。
4、2.2.采血，取血采血，取血1010ulul。3.3.擦去管外的血擦去管外的血，轻吹入试管底部，轻吹入试管底部，再再漱洗吸管漱洗吸管2 2 3 3次，次，立即混匀立即混匀。4.4.混匀混匀后充入计数室后充入计数室，静置静置3 3 5 5 minmin，高倍镜下计数。高倍镜下计数。(RBC)充液位置充液位置 充液位置充液位置 为红细胞计数区域为红细胞计数区域 压线细胞的计数原则压线细胞的计数原则：数左不数右数左不数右，数上不数下数上不数下 五五.计算计算 RBC/LRBC/L5 5个中方格内个中方格内RBCRBC数数/5/52525101020020010106 6 5 5个中方格内个中方格内R
5、BCRBC数数/100/10010101212 六六.报告方式报告方式 10101212L L R R B B C C ：(RBC)七七.参考值参考值 男性：男性：(4.0(4.05.5)5.5)10101212L L 女性：女性：(3.5(3.55.0)5.0)10101212L L 新生儿：新生儿：(6.0(6.07.0)7.0)10101212L L 400400550550 万万/ulul 350350500500 万万/ulul (RBC)八八.注意事项注意事项 1.1.采血时不要过分挤压。采血时不要过分挤压。2.2.取血量必须准确，动作要迅速，防止取血量必须准确，动作要迅速，防止
6、血液凝固。血液凝固。3.3.血液加入稀释液后，应立即混匀。血液加入稀释液后，应立即混匀。4.4.充池前要摇匀充池前要摇匀，充池时不能产生气泡。，充池时不能产生气泡。5.5.压线细胞应数上不数下压线细胞应数上不数下，数左不数右。数左不数右。(RBC)亚铁血红素亚铁血红素 亚铁血红素亚铁血红素 珠蛋白珠蛋白 亚铁血红素亚铁血红素 亚铁血红素亚铁血红素（原卟啉、（原卟啉、FeFe2+2+）（原卟啉、原卟啉、FeFe2+2+）（原卟啉、（原卟啉、FeFe2+2+）（原卟啉、原卟啉、FeFe2+2+）（HemoglobinHemoglobin，HbHb或或HGBHGB）亚铁血红素结构示意图亚铁血红素结构
7、示意图 HbAHbA：2 22 2 成人占成人占9090%以上以上 HbAHbA2 2：2 22 2 成人约占成人约占2 23%3%HbF(HbF(胎儿胎儿Hb)Hb)：2 22 2 成人成人2%2%以下以下 HbOHbO2 2(氧合血红蛋白氧合血红蛋白)HbredHbred(还原血红蛋白还原血红蛋白)HbCOHbCO(碳氧血红蛋白碳氧血红蛋白)Hi Hi(高铁血红蛋白高铁血红蛋白)SHbSHb(硫化血红蛋白硫化血红蛋白)主要成分主要成分 少量少量 与氧结合与氧结合 空着空着 与与COCO结合结合 FeFe2 2FeFe3 3 与与S S结合结合 氰化高铁血红蛋白测定法（氰化高铁血红蛋白测定法
8、（HiCNHiCN法）法）碱羟高铁血红素法（碱羟高铁血红素法（AHD575AHD575法）法）十二烷基硫酸钠血红蛋白法十二烷基硫酸钠血红蛋白法(SDSSDS-HbHb法法)沙利沙利(Sahli)Sahli)法法 (县及县以上医院已淘汰县及县以上医院已淘汰)一一.原理原理 HbHb CNCN 氧化氧化 HiCNHiCN为棕红色，最大吸收峰为棕红色，最大吸收峰540540nmnm。根据标本的吸光度可知根据标本的吸光度可知HbHb浓度。浓度。HiCNHiCN HiHi (HiCN(HiCN法法)注：注：硫化血红蛋白硫化血红蛋白(SHb)SHb)不能被转化不能被转化 氰化钾氰化钾 0.050.05g
9、g 高铁氰化钾高铁氰化钾 0.20.2g g 磷酸二氢钾磷酸二氢钾 0.140.14g g 非离子表面活性剂非离子表面活性剂 1.01.0mlml 蒸馏水蒸馏水 加至加至10001000mlml 二二.试剂试剂 HiCNHiCN转化液转化液(文齐液文齐液)调调pH7.0pH7.07.47.4，置置棕色玻璃瓶棕色玻璃瓶中密封保存。中密封保存。氧化氧化 调节调节pHpH 促溶促溶,防混浊防混浊 (HiCN(HiCN法法)提供提供CNCN-三三.方法方法 4.4.实际工作中，可用实际工作中，可用HiCNHiCN参考液，按生化方参考液，按生化方 法绘制标准曲线，或求出法绘制标准曲线，或求出K K值后计
10、算。值后计算。K KHbHb（g g）/A/A 1.1.5.05.0 mlml HbHb转化液血转化液血2020ul,ul,混匀混匀,静置静置5 5minmin。2.2.分光光度计比色，波长分光光度计比色，波长540540nmnm，以空白转化以空白转化 液调零，测定吸光度液调零，测定吸光度“A A”。3.3.如用符合如用符合WHOWHO标准的光度计，则可据标准的光度计，则可据“A A”直直 接计算接计算HbHb浓度。浓度。Hb(g/L)Hb(g/L)A A540540 /44000/440006445864458251251A A367.7367.7 氰化高铁血红蛋白标准曲线00.10.20.
11、30.40.50.60.050.0100.0150.0200.0250.0Hb(g/L)A540Hb(g/L)A 50 0.128 100 0.265 150 0.385 200 0.523 K=Hb/A =500/1.301 =384.32 Hb=K A 1 1.KCNKCN为剧毒药品为剧毒药品，防污染防污染。2 2.HbHb转化液不能存于塑料瓶中转化液不能存于塑料瓶中。否则否则CNCN-下降下降，结果偏低结果偏低。3 3.分光光度计应校正后使用分光光度计应校正后使用。4.4.标准曲线或标准曲线或K K值应值应定期校正定期校正。四四.注意事项注意事项 HiCNHiCN法法 SDSSDS-Hb
12、Hb法法 优点：操作简单；结果稳定。优点：操作简单；结果稳定。缺点：氰化钾有剧毒；缺点：氰化钾有剧毒；高白细胞或高球蛋白血症可致浑浊；高白细胞或高球蛋白血症可致浑浊；HbCOHbCO转化较慢。转化较慢。推荐方法推荐方法 优点：操作简单；结果稳定；无公害。优点：操作简单；结果稳定；无公害。缺点：摩尔消光系数未确定；缺点：摩尔消光系数未确定；SDSSDS本身质量差异较大；本身质量差异较大；破坏白细胞。破坏白细胞。次选方法次选方法 如何采用如何采用SDSSDS-HbHb法进行血红法进行血红蛋白测定？蛋白测定？1.HiCN1.HiCN法标准曲线绘制法标准曲线绘制 2.SDS2.SDS-HbHb法标准工
13、作曲线绘制法标准工作曲线绘制 1)1)取取4 4份不同浓度抗凝血或溶血液用份不同浓度抗凝血或溶血液用HiCN HiCN 法测定吸光度，并求出其法测定吸光度，并求出其HbHb浓度。浓度。2)2)再用再用SDSSDS-HbHb法测定法测定4 4份标本的吸光度。份标本的吸光度。3)3)以以4 4份标本份标本HbHb浓度为横坐标，浓度为横坐标，SDSSDS-HbHb法测得法测得 的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。3.SDS3.SDS-HbHb法测定待测标本法测定待测标本 成男：成男：120120160160g/Lg/L 成女：成女：110110150150g/Lg
14、/L 新生儿：新生儿：170170200200g/Lg/L 一一.年龄与性别的差异年龄与性别的差异 二二.精神因素精神因素 激动激动、恐惧恐惧、冷水浴使冷水浴使 三三.剧烈体力运动和劳动剧烈体力运动和劳动 缺氧，使缺氧，使 四四.气压降低气压降低 缺氧，使缺氧，使 五五.妊娠中、后期妊娠中、后期 血液稀释，使血液稀释，使 6个月个月2岁婴幼儿岁婴幼儿 造血原料不足造血原料不足，使使 某些老人某些老人 造血功能减退，使造血功能减退，使 新生儿新生儿 母体内相对缺氧，使母体内相对缺氧，使 一一.相对性增多相对性增多 二二.绝对性增多绝对性增多 2 2.继发性红细胞增多继发性红细胞增多 1 1.原发
15、性红细胞增多原发性红细胞增多 血液浓缩血液浓缩 常见于：心血管疾病、肺部疾病、常见于：心血管疾病、肺部疾病、异常血红蛋白病等异常血红蛋白病等 常见于真性红细胞增多症等常见于真性红细胞增多症等 见于各种贫血见于各种贫血 贫血的病因分类贫血的病因分类 RBCRBC、HbHb和和HctHct低于参考值下限。低于参考值下限。贫血：贫血：1.1.红细胞生成障碍红细胞生成障碍 2.2.红细胞破坏过多红细胞破坏过多 3.3.红细胞丢失过多红细胞丢失过多 造血原料不足造血原料不足 骨髓造血功能减退骨髓造血功能减退 见于各种溶贫见于各种溶贫 见于各种出血见于各种出血 贫血时贫血时RBCRBC和和HbHb减少程度
16、可不一致减少程度可不一致 正色素性贫血：二者成比例减少正色素性贫血：二者成比例减少 小细胞低色素性贫血：小细胞低色素性贫血：RBCRBC，HbHb 大细胞性贫血：大细胞性贫血：RBCRBC，HbHb 红细胞计数与血红蛋白测定值一定能红细胞计数与血红蛋白测定值一定能正确反映全身红细胞正确反映全身红细胞总量总量的多少吗？的多少吗？为什么？为什么？大量失血尚未补液前：大量失血尚未补液前：脱水：脱水：红细胞总量减少红细胞总量减少,但但RBCRBC和和HbHb测定值不能反映。测定值不能反映。红细胞总量未减少，但红细胞总量未减少，但RBCRBC和和HbHb测定值显示其测定值显示其增多，如贫血时则可掩盖贫血。增多，如贫血时则可掩盖贫血。红细胞形态检查（三）红细胞形态改变（三）红细胞形态改变 正常红细胞呈双凹圆盘形，在血涂正常红细胞呈双凹圆盘形，在血涂片中见到为圆形，大小较一致，直径片中见到为圆形，大小较一致，直径69m，平均平均7.5m。病理情况下外周血中常见的红细胞病理情况下外周血中常见的红细胞形态有以下几种：形态有以下几种：1 1、大小异常、大小异常 （1）小红细胞（）小红细胞（microcyt