1、书 书 书?犌犅?犅?书 书 书犌犅 前言本标准代替 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素 的测定。本标准与 相比，主要变化如下：增加了第一法液相色谱法；增加了第二法液相色谱质谱法；删除了规范性引用文件；修改了原微生物法为第三法。犌犅 食品安全国家标准食品中维生素犅 的测定范围本标准规定了食品中维生素 的测定方法。第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素 的测定。第二法液相色谱质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素 的测定。第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素 的测定。第一法液相色谱法原理试样经酶解后，用
2、氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和 脱氧腺苷钴胺素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 规定的一级水。试剂 无水乙酸钠（）。乙酸（）。甲醇（）：色谱级。乙腈（）：色谱级。三氟乙酸（）：色谱级。氰化钾或氰化钠（）。胃蛋白酶（号：，活力 ）。淀粉酶（活力）。乙醇（）。试剂配制 乙醇溶液（）：量取 乙醇，加水稀释至 ，混匀。乙酸钠缓冲液（）：称取 无水乙酸钠，用 水溶解并用乙酸调至 ，用水稀释至 。犌犅 氰化钾（或氰化钠）溶液（）：称取 氰化钾（或氰化钠）固体，加适
3、量水溶解，并用水稀释至 。注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。三氟乙酸溶液（，体积比）：量取 水，加入 三氟乙酸，混匀。标准品维生素（氰钴胺素）标准品（，号：）：纯度，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。标准溶液配制 维生素 标准储备液（）：称取（精确至 ）维生素 标准品于 烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至 容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于 下避光保存，有效期个月。维生素 标准工作液（）：吸取 维生素 标准储备液，置于 容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于下避光保存，有效期个月
4、。维生素 标准系列工作溶液：准确吸取标准工作液、和 ，分别置于 容量瓶中，用水定容至刻度。其浓度分别为：、和 。临用现配。材料 维生素 免疫亲和柱，柱容量 ，柱回收率（验证方法参见附录）。玻璃纤维滤纸。微孔滤膜：水相，。仪器和设备 液相色谱仪：带紫外检测器。天平：感量为 、和 。计：精度 。水浴恒温振荡器：温度范围 。超声波清洗器。离心机：转速 。分析步骤注：操作过程应避免紫外光照，并尽可能避光操作。样品前处理 试样制备固体样品粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。犌犅 样品提取称取 试样（精确至 ）于 具塞锥形瓶中，依次加入 乙酸钠缓冲液、胃蛋白酶、淀粉酶和氰化钾
5、（或氰化钠）溶液，充分混合。将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在，酶解 （肉类样品酶解 ），酶解后转入 水浴中，保持 ，取出冷却至室温。将样品溶液转移至 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。移取上述溶液 至 离心管中，在 下离心 ，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的样品，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰化钠）。净化将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，移取适量上述滤液（其中含维生素 为 ）过柱，调节过柱速度为 。待样液完全过柱后，用 水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置 玻璃试管，用甲醇分次洗脱，收集
6、全部洗脱液，在 以下用氮气流缓缓吹至近干，用 三氟乙酸溶液定容至，涡旋 溶解残留物，滤膜过滤，待测。注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的加入），使氰化物分解，放置 后排放。液相色谱参考条件 色谱柱：柱（柱长 ，柱内径，填料粒径），或相当者。流动相：相，三氟乙酸溶液；相，乙腈。梯度洗脱：，；，；，。流速：。柱温：。进样体积：。检测波长：。标准曲线的制作将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以维生素 的峰面积为纵坐标，以维生素 的浓度为横坐标绘制标准曲线。液相色谱图见附录中图。样品测定将待测样液注入液相色谱
7、仪中，得到待测溶液中维生素 的峰面积，根据标准曲线得到测定液中维生素 的浓度。待测样液中维生素 的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应稀释上机溶液，或调整取样量重新按样品分析步骤处理后再进样分析。空白试验不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。分析结果的表述试样中维生素（以氰钴胺素计）的含量按式（）计算：犌犅 犡犞犞 犿犞 （）式中：犡 试样中维生素 的含量，单位为微克每百克（）；由标准曲线得到的试样溶液中维生素 的浓度，单位为纳克每毫升（）；犞 样品提取液的定容体积，单位为毫升（）；犞 试样过柱洗脱液的最终定容体积，单位为毫升（）；换算系数；犿 试样的取样量，
8、单位为克（）；犞 上柱溶液的体积，单位为毫升（）；换算系数。计算结果保留两位有效数字。精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的。其他当取样量为 时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品的检出限为 ，定量限为 。第二法液相色谱质谱法原理试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和 脱氧腺苷钴胺素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 规定的一级水。试剂 无水乙酸钠（）。氢氧化钠（）。乙酸（）。乙腈（）：色谱纯。乙酸铵（）：色谱纯。
9、氰化钾或氰化钠（）。胃蛋白酶（号：，活力 ）。犌犅 淀粉酶（活力）。乙醇（）。试剂配制 乙醇溶液（）：量取 乙醇，加水稀释至 ，混匀。乙酸钠缓冲液（）：称取 无水乙酸钠，用 水溶解并用乙酸调至 ，用水稀释至 。氰化钾（或氰化钠）溶液（）：称取 氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至 。注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品，操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。氢氧化钠溶液（）：称取 氢氧化钠，加适量水溶解，并用水稀释至 。乙酸铵溶液（）：称取 乙酸铵，加适量水溶解，并用水稀释至 。乙腈溶液（，体积比）：量取 水加于 乙腈中，混匀，超声脱气。标准品 维生
10、素（氰钴胺素）标准品（，号：）：纯度，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。维生素 同位素内标溶液（）：甲醇溶液。标准溶液配制 维生素 标准储备溶液（）：称取（精确至 ）维生素 标准品于 烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至 容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于 下避光保存，有效期个月。维生素 标准中间溶液（）：吸取 维生素 标准储备溶液，置于 容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于下避光保存，有效期个月。维生素 标准工作溶液（）：吸取 维生素 标准中间溶液，置于 容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于下避光保存，有效期一周。维生素 同位素内标工作
11、液（）：吸取 维生素 同位素内标溶液（），置于 容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于下避光保存。标准系列溶液：分别准确移取 的维生素 标准工作溶液、和 于容量瓶中，各加入 同位素内标工作液（），用水定容至刻度，摇匀。其中，维生素 的浓度分别为、和 。维生素 同位素内标的浓度为。临用现配。材料 维生素 免疫亲和柱，柱容量 ，柱回收率（验证方法参见附录）。玻璃纤维滤纸。微孔滤膜：水相，。仪器和设备 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾电离源（）。犌犅 天平：感量为 、和 。计：精度 。水浴恒温振荡器：温度范围 。超声波清洗器。离心机：转速 。分析步骤注：操作过程应避免紫外光照射，并尽可能避光
12、操作。样品前处理 试样制备固体样品需粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品测定前振摇混匀。提取 婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物称取混匀后的试样（精确至 ）于 离心管中，依次加入 同位素内标工作液、乙酸钠缓冲液、胃蛋白酶、淀粉酶和氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在 下，振荡酶解 （肉类样品需酶解 ），酶解后转入 水浴中，保持 ，取出冷却至室温。在 下离心 ，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。饮料称取混匀后的试样（精确至 ）于 离心管中，加入 同位素内标工作液，用氢氧化钠溶液调至（碳酸饮料需在超声波振荡器中脱气 后再调），在 下离心 ，
13、取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。果冻称取混匀后的试样（精确至 ）于 离心管中，加入 同位素内标工作液，加入 水，涡旋混匀，于 水浴中溶解试样，于 水浴超声 ，用氢氧化钠溶液调至，在 下离心 ，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的试样，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰化钠）。净化将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，转移全部滤液过柱，调节过柱速度为 。待样液完全过柱后，用 水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置 玻璃试管，用甲醇分次洗脱，收集全部洗脱液，在 以下用氮气流缓缓吹至近干，用乙酸铵溶液定
14、容至，涡旋 溶解残留物，滤膜过滤，待测。注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的加入），使氰化物分解，放置 后排放。犌犅 仪器参考条件 液相色谱参考条件 色谱柱：柱（柱长 ，柱内径，填料粒径），或相当者。流动相：相，乙酸铵溶液（）；相，乙腈溶液（，体积比）。洗脱梯度：，；，；，；，；，；，。流速：。柱温：。进样体积：。质谱参考条件 电离方式：。离子源温度：。锥孔反吹气流量：。脱溶剂气温度：。脱溶剂气流量：。多反应监测（）模式，锥孔电压和碰撞能量见表，谱图见附录中图。表离子对参考条件化合物名称母离子犿狕碎片离子犿狕锥孔电压碰撞能量维生素 维生素
15、 同位素内标 定量离子。定性测定在相同的测试条件下，试样溶液中目标化合物的保留时间与相应标准溶液中目标化合物的保留时间相比，偏差在 以内，且检测到的离子相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致，其允许偏差应符合表的要求。表定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 允许相对偏差 标准曲线的制作将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱串联质谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以犌犅 维生素 与其同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以维生素 的浓度为横坐标绘制标准曲线。样品测定将待测样液注入液相色谱串联质谱仪中，得到待测溶液中维生素 与其同位素内标的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生
16、素 的浓度。待测液中维生素 的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应减少取样量，重新按样品分析步骤处理后再进样分析。空白试验不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。分析结果的表述试样中维生素（以氰钴胺素计）的含量按式（）计算：犡犞 犿 （）式中：犡 试样中维生素 的含量，单位为微克每百克（）；由标准曲线得到的试样溶液中维生素 的浓度，单位为纳克每毫升（）；犞 试样过柱洗脱液的定容体积，单位为毫升（）；换算系数；犿 试样的取样量，单位为克（）；换算系数。计算结果保留两位有效数字。精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的。其他当取样量为 时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物的检出限为 ，定量限为 。当取样量为 时，饮料的检出限为 ，定量限为 。当取样量为 时，果冻的检出限为 ，定量限为 。第三法微生物法 原理维生素 是莱士曼氏乳酸杆菌生长所必需的营养素。在一定条件下，莱士曼氏乳酸杆菌的生长与维生素 的含量成对应关系。根据维生素 的含量与透光率（或吸光度值）的标准工作曲线，计算出试样中维生素 的含量。犌犅 试剂和材