1、核酸抽提经验及原理总结 一、核酸 核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最根本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔（f.miescher）在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼（r.altmann）于1889年认识其酸性后，定名为核酸。 二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸（rna）和脱氧核糖核酸（dna）两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。dna贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结
2、构和信息含量相同的dna；rna主要在蛋白质合成中起作用，负责将dna的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。核酸的根本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。dna和rna中的戊糖不同，rna中的戊糖是d-核糖；dna不含核糖而含d-2-脱氧核糖（核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代）。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，dna和rna的碱基也有所不同。下面我们看看dna和rna具体的差异： （一）dna的分子结构 1.dna的碱基组成规律：chargaff等根据分析各种生物及其不同组织内dna样品水解液中的碱基含量的结果，得出以下结论
3、：1）同一生物不同组织的dna样品，其碱基成分含量相同。2）不同生物的dna碱基成分含量不同。3）对某一生物讲，其碱基成分的含量不受年龄、营养及环境变化等影响。4）在同一生物的dna碱基含量是a=t，g=c，a+g=c+t，碱基之间的这种关系称chargaff法那么。 2.dna分子的根本结构。核酸分子内单核苷酸之间的连接键为3，5-磷酸二酯键，是共价键。dna分子的根本结构就是许多脱氧核糖核苷酸借磷酸二脂键相互连接而成的多核苷酸链。dna链中碱基的组成和排列顺序即为dna的一级结构。dna的遗传信息即储存在dna分子的碱基排列顺序中。 .dna分子的空间结构：dna的二级结构是双螺旋结构，其
4、特点为：1）两条链方向相反、相互平行、主链是磷酸戊糖链，处于螺旋外侧。2）碱基在螺旋内侧并配对存在，a与t配对的g与c配对，a与t之间二个氢键相连（a-t），g与c之间三个氢键相链（g-c）。3）螺旋直径2nm，二个碱基对平面距0。34mm，2023bp为一螺距，距离为3。4nm。4）稳定因素主要是碱基之间的氢键和碱基对平面之间的堆积力。 （二）rna的分子结构 rna的根本结构是a、g、c、u四种碱基组成的核糖苷酸通过磷酸二酯键相链而成的多核苷酸链。有三种主要的rna：据其作用可分转运rna（trna）、信使rna（mrna）和核蛋白体rna（rrna），它们的二级结构是单链局部双螺旋，共中
5、trna结构较清楚： 1.trnatrna一级结构特点是：1）核苷酸数目在70-90之间；2）含较多稀有碱基；3）所有trna的3末端均是-cca的结构。trna二级结构特点：呈三叶草形，有三环四臂。其中3的氨基酸臂是携带氨基酸的位置，ii环又称反密码环，此环顶端由3个碱基组成反密码子，起到识别mrna上对于密码子的作用。 2.mrnamrna是蛋白质合成的模板，真核生物的mrna的5端有m7gppp的帽子，3末端有20-200多聚a的尾巴上述两者之间为信息区，其中每三个相邻碱基组成一个三联体，代表一个氨基酸信号，即为密码子。不同mrna具有不同的密码顺序，决定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序（一
6、级结构）。 3.rrna核蛋白体rna，它是细胞内含量最多的rna：rrna与多种蛋白质结合成核蛋白体，存在于胞浆，是蛋白质合成的部位。 三、核酸的理化性质 rna和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，dna那么为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。dna、rna和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，rna钠盐在水中溶解度可达40g/l，dna钠盐在水中为2023g/l，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，dna、rna易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的dna是以脱氧核糖核蛋白（dnp）形式存
7、在于细胞核中。要从细胞中提取dna时，先把dnp抽提出来，再把p除去，再除去细胞中的糖，rna及无机离子等，从中别离dna。 四、细胞裂解： （一）裂解原理 在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂（如 sds、tritonx-20230、np-40、tween20等）和盐（如tris、edta、nacl等）。盐的作用，除了提供一个适宜的裂解环境（如tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如edta）、维持核酸结构的稳定（如nacl）等。去污剂那么是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中
8、还可能参加蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如git、guhcl等）裂解的，该方法已经成为了rna抽提的主流，却不是基因组dna抽提的主流。 （二）细胞的裂解方法 细菌细胞破碎方法有以下几种：1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法，关于超声波处理法，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间。2）化学试剂法：用含sds或ctab的溶液处理细胞，在一定的ph环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相，ph环境那么由参加的强碱（na
9、oh）或缓冲液（te、ste等）提供，外表活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（edta等）可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子mg2+、ca2+，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。；3）反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4）酶解法：参加溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶k等，都可使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的别离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸残基间的-（1，4）键水解。蛋白酶k能催化水解多种多肽
10、键，其在65及有edta、尿素（14mol/l）和去污剂（0.5%sds或1%tritonx-20230）存在时仍保存酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中，酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待别离的核酸类型及后续实验目的来确定。 （三）裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组dna的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组dna相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组dna是很容易“缠住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，那么不容易被基因组dna
11、“缠住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组dna的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组dna与 蛋白质“缠在一起，在纯化的过程中有两种可能。如果基因组dna的特性占优势，那么纯化时以dna的形式被保存下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，那么纯化时以蛋白质的形式被去除，导致dna的损失。当然去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组dna抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用pc抽提的差一些。 高浓度蛋白质变性剂（如git、g
12、uhcl等）的裂解方法，是抽提rna的首选。总rna的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组dna相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的rna酶，从而确保了rna的完整性。除了极少量不适用该方法的样品主要是植物，其它绝大局部样品的rna的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为根底的。当然有些样品，如肌肉，即使是rna抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质），原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯
13、度的根底。 含ctab的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组dna抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是ctab的质量，二是洗涤的彻底程度。ctab的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的ctab，批号不同，效果就可能差异很大。洗涤去除ctab要比其它的盐难一些，同时，ctab的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用65c；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下37c45c这个相对低温的区域。 sds碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几
14、乎无基因组dna污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在4c会更好一些，所以，参加溶液iii后在4静置一段时间以及采用4离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用pc纯化，但结合pc纯化，可以获得纯度很高的质粒。rna的去除可以靠在溶液i中参加rnasea（20230ug/ml）或者在最后的溶解液中参加rnasea（25ug/ml）来实现。总的感觉是，在溶液i中使用rnasea，rna的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有方法彻底去除rna残留。另外，对大质粒（50kb以上），该方法可能会有问题。 pcr模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类
15、方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于pcr，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法最简单的就是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，pcr检测就可以了。如果使用裂解法，哪么最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的pcr反响，而且能提高裂解效率，甚至还可能局部消除样品内抑制pcr反响杂质的东西，如tritonx-20230、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如chelex20230之类的能吸附局部杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的屡次循环等。该方法
16、最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着pcr的抑制物量的降低。 （四）样品与裂解液的比例 选择了适宜的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。这个问题非常重要，但却没有获得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如1ml裂解液可以用于tmg组织或者c个细胞；建议：样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，那么以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的根底，会比较合理的。不要因为1ml裂解液可以抽提20230mg样品，就一