1、血管紧急素转换酶在肺栓塞大鼠肺动脉中的表达及其对肺动脉血管的影响 目的 通过观看肺栓塞大鼠肺动脉干、外周血中血管紧急素转化酶ACE2在栓塞发生后不同时间点的表达状况，分析其在肺动脉血管重构中的作用。 方法 将雄性SD清洁级大鼠120只按随机数字表法分为比照组、假手术和栓塞组，每组各40只。栓塞组大鼠再随机分为5个亚组，即栓塞24 h组、栓塞1周组、栓塞2周组、栓塞4周组和栓塞8周组。在相应的时间点进行肺动脉干、外周血中的ACE2含量检测及肺动脉干的病理检查。 结果 与比照组比拟，假手术组大鼠肺动脉干、外周血中的ACE2的表达差异无统计学意义P 0.05；栓塞组大鼠在栓塞1、2、4、8周后肺动脉
2、干、外周血中的ACE2的表达均显著降低P 0.05. While the concentrations of ACE2 in pulmonary embolism group were significantly lower than those in control group at 1 week， 2 weeks， 4 weeks and 8 weeks after embolization P 0.01. Meanwhile， pathological examination results showed clearly the infiltration of inflammatory
3、cells around pulmonary artery trunk， pulmonary fibrosis and vascular remodeling with a hyperplasia of granulation tissue. Conclusion The expression of ACE2 reduced significantly in pulmonary embolism rat model， and the low concentrations of ACE2 may aggravate pulmonary vascular remodeling.Key words
4、Pulmonary embolism； Angiotensin converting enzyme 2； Vascular remodeling； Rat肺血栓栓塞癥pulmonary thromboembolism，PTE是来自静脉系统或右心的血栓堵塞肺动脉或其分支所致疾病，其以肺循环含右心和呼吸功能障碍为主要临床表现和病理生理特征，也是最常见的肺栓塞类型1。全球流行病学资料显示其发病率在千分之一以上，每年患病人数约60万2。在我国，PTE也是常见的心血管系统疾病之一3。PTE的病理生理学变化简单多变，栓塞发生后，由于肺血管内皮受损，释放出内皮素、血管紧急素angiotensin，Ang、二
5、磷酸腺苷、组织胺、5-羟色胺、多种前列腺素等血管收缩性物质，使肺血管收缩，呼吸循环功能障碍，从而产生一系列心肺功能特别。急性PTE即使进行抗凝治疗1年后，仍有半数患者存在残留血栓。据报道，PTE发生14周内未溶、残留的栓子与肺动脉壁黏为一体，产生血管组织炎性反响，并渐渐转化为含有内皮细胞、平滑肌细胞的结缔组织，迁移到动脉内膜，可引起以肺动脉内膜纤维化为主要表现的血管重构4-5。这种血管重构造成血管腔狭窄、堵塞，导致栓塞部位通气、血流灌注障碍，引起以右心衰竭、低氧血症及低碳酸血症等为主的机体一系列病理生理变化，严峻的可危及生命。针对这种血管重构的机制，已有争辩说明神经-体液因素和循环内分泌激素起
6、了格外重要的作用，其中肾素-血管紧急素系统RAS这一经典的循环酶通路是体内重要的体液调整系统之一。Ang是RAS的重要代谢产物。Ang 作为极强的缩血管物质，能被血管紧急素转化酶angiotensin converting enzyme 2，ACE2水解生成血管紧急素-1-7angiotensin-1-7，ANG-1-7，而ANG-1-7对肾素-血管紧急素系统具有负调控的作用。本争辩借助肺栓塞动物模型，通过观看肺栓塞后不同时间点大鼠肺动脉干、外周血中的ACE2的表达状况，分析其对大鼠肺动脉血管重构的影响，为PTE的预防及临床诊疗供给试验依据。1 材料与方法1.1 试验动物选取34周龄雄性SD清
7、洁级大鼠120只，由福建医科高校试验动物中心供给，生产许可证号为SCXK闽2023-0002，合格证号为0002678，体重23020g。试验大鼠饲养于12 h光照/12 h黑暗的SPF级环境中，自由摄食和饮水，动物适应1周后进行试验。1.2 试剂兔ACE2多克隆抗体由Abcam公司供给；免疫组化检测试剂：DAB染色液由珠海市泉辉企业供给，抗体稀释液由基因科技上海股份供给；大鼠ACE2检测的ELISA试剂盒由上海美旋生物技术供给。1.3 方法1.3.1 大鼠肺栓塞模型的建立 将120只大鼠按随机数字表法分为比照组、假手术和栓塞组，每组各40只。栓塞组又依据栓塞时间不同分为24 h、1周、2周、
8、4周和8周5组，每组8只动物。用2%的戊巴比妥钠依据0.5 mL/100 g体重的剂量进行腹腔注射，麻醉大鼠后在无菌条件下分别左侧颈外静脉，并按1 mL/kg体重静脉推注无菌生理盐水条件下制成的2.5 g/L的明胶海绵溶液，建立肺栓塞模型6。假手术组大鼠颈静脉注入同等体积的生理盐水后也同样结扎颈外静脉近端，缝合皮下组织、皮肤后，放回饲养笼内饲养。1.3.2 动物标本采集 分别在造模后24 h、1 周、2周、4周、8周取动物外周血，离心获血清进行ACE2含量检测。同时，在上述不同时间点猎取大鼠的左肺动脉干，经4%多聚甲醛固定，进行HE染色及相关免疫组化检测。1.3.3 血清ACE2含量检测 利用
9、ELISA法测定清ACE2含量。向预先已包被大鼠血清ACE2捕获抗体的微孔中，依次参加待测血清标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过适当的温浴及洗涤，利用底物TMBTMB在过氧化物酶的催化下转为蓝色，在酸的作用下转成最终黄色在450 nm的吸光度值，进行ACE2浓度的测定。1.3.4 大鼠肺动脉干ACE2免疫组化检测 首先将标本石蜡切片在68条件下烘烤脱蜡至水化后，将玻片放置装有已沸腾柠檬酸抗原修复液的压力锅中25 min；自然冷却后用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液PBS清洗2次；3%过氧化氢孵育5 min以灭活内源性过氧化物酶，再用PBS清洗2次；参加ACE2兔多克隆抗体1100，4过
10、夜孵育，然后PBS清洗2次；滴加二抗，室温孵育30 min后，PBS清洗2次；最终进行DAB显色；纯化水充分冲洗，苏木精复染，酒精分色，PBS复色，酒精梯度脱水，二甲苯透亮，树胶封片。与此同时，用PBS分别代替一抗、二抗作为阴性比照。接受Bresalier等7的半定量公式推断染色结果。每张切片在400倍视野下随机选取10个视野，依据细胞染色强度分为4级，并分别计分如下：细胞无着色0；细胞着色为浅黄色1；细胞着色为棕黄色2；细胞着色为棕褐色3。同一视野依据染色为浅黄色以上细胞的面积占视野面积的比例计分：0%30%为0分；30%50%为1分；50%80%为2分，80%为3分；将同一视野两项计分相加
11、为该视野的积分。将10个视野的积分代入以下计算公式计算每张切片的平均染色强度：IS=0F0+1F1+2F2+3F3+4F4+5F4+6F6，F=n/l0n=0、1、2、3、4、5、6各分值的视野数。接受双人双盲阅片方式，重复2次，分别计算IS值，取其平均值作为最终结果。1.3.5 肺动脉干形态学分析 接受常规苏木精-伊红染色，通过电子显微镜观看血栓、内皮细胞、水肿、炎症细胞、纤维蛋白、纤维母细胞、肉芽组织等状况。图像分析是接受Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。1.4 统计学方法数据接受GB-STAT统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数标准差xs表示，多组间比拟接受单因素方差分析，组间两两比拟接受LSD-t检验，以P 0.05。相比之下，栓塞组1、2、4周外周血ACE2浓度极显著低于比照组P 0.01；与栓塞24 h比拟，栓塞组8周外周血ACE2浓度略有上升P 0.05，但仍显著低于同时间点的比照组外周血ACE2浓度P 0.05。见表1。2.2