1、葫芦巴种子提取物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响黄小蕾 孙明振摘 要：目的：探讨不同溶剂萃取葫芦巴乙醇提取液对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法：利用MTT法检测葫芦巴乙醇提取物各层萃取物对MCF-7细胞的抑制作用，TUNEL法检测对MCF-7细胞凋亡的影响。结果：高浓度100g/ml萃取物对MCF-7有一定的抑制作用，其中正丁醇层萃取物抑制作用最强77.650.57，凋亡率比对照组增加64.12%。结论：葫芦巴乙醇提取物正丁醇萃取物有诱导MCF-7细胞凋亡的作用。关键词：葫芦巴种子;提取物;乳腺癌;影响乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，已经成为女性健康的最大威胁。常规化疗药物的毒副作用和多药
2、耐药性是成为化疗失败的主要原因。中草药提取物在治疗肺癌及减毒增效方面开展迅速，在治疗肺癌方面有着巨大潜力。葫芦巴为豆科葫芦巴属植物，是世界上最早的药用植物之一。目前对葫芦巴的研究已经说明其具有抗氧化1、抗糖尿病2、降胆固醇3、抗生育4、抗免疫、抗肿瘤5等作用。本实验报道葫芦巴种子醇提取物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。1 材料1.1细胞人乳腺癌MCF-7细胞株，购于广州吉妮欧生物科技。1.2药物与试剂葫芦巴Trigonella foenum-graecum L.购置于国药控股漯河，经鉴定为豆科植物蒙古葫芦巴的枯燥根。MTT、碧云天TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购于郑州天驰生物。2 实验方法2
3、.1药物制备取枯燥的葫芦巴药材100g，粉碎至适宜粒度，用 1000mL75%乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味，加水分散至100mL制成水混悬液。分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分取有机层，得到4个局部：石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层局部。将提取的各个局局部别减压回收溶剂至干，加适量95%乙醇溶解，再加蒸馏水稀释乙醇终浓度1.5%制成实验所需浓度的混悬液。2.2细胞培养将乳腺癌MCF-7细胞置于恒温培养箱中CO2浓度：5%，T：37，用RMPI 1640完全培养液含10%胎牛血清和1%双抗培养，每天换液一次，换液前观察细胞生长情况，平均2天传代一次观察细胞贴壁生长至培养瓶的80%
4、-90%左右即可传代。传代方法：除去培养瓶中的培养液，用PBS液冲洗2-3遍后参加0.25%胰蛋白酶0.8ml，消化3-4分钟，待消化完全后细胞间隙变大，形状变圆即为消化完全，立即参加RMPI164培养液终止消化，轻柔吹打贴壁细胞使其充分脱落后分装，放入恒温培养箱中继续培养。2.3 MTT检测法收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，细胞培养版96孔板每孔参加100ul，铺板使待测细胞调密度至10000孔，边缘孔用无菌PBS填充;5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底，参加浓度梯度的药物;5%CO2，37孵育48小时;每孔参加20ulMTT溶液5mg/ml，即0.5%MTT，继续培养4h;终止培养
5、，小心吸去孔内培养液;每孔参加150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解;在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。上述实验重复3次。计算公式：细胞生长抑制率%=1-实验孔A值-对照孔A值/对照孔A值100%。2.4 TUNEL实验收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，细胞培养板6孔板每孔参加2ml，铺板使待测细胞调密度至1.6106/孔。5%CO2，37孵育，待细胞贴壁。参加正丁醇层萃取物，孵育48H。PBS洗涤1次，用4%多聚甲醛固定60分钟;PBS洗涤1次，参加免疫染色洗涤液，冰浴孵育2分钟，再用甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液中室温孵育20分钟，PBS洗涤1次
6、;配制生物素标记液，在样品上加50l生物素标记液，37孵育60分钟，PBS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反响终止液，室温孵育10分钟。显色，荧光显微镜下观测。每个实验组检测200个细胞来判断细胞凋亡情况。2.5统计学处理应用SPSS 17.0统计处理软件进行统计分析，结果以 xs表示，采用方差分析和t检验进行比拟。P0.05有统计学意义。3 结果3.1 MTT法检测葫芦巴提取物对MCF-7的抑制作用利用MTT法检测葫芦巴醇提物各层萃取物高100g/ml、中10g/ml、低1g/ml三个浓度分别对MCF-7细胞的抑制作用。各层萃取物低中浓度对MCF-7细胞的抑制作用较弱，高浓度萃取物对MC
7、F-7有一定的抑制作用，其中正丁醇层萃取物抑制作用最强。结果如表1所示。3.2 MTT法检测正丁醇层萃取物对MCF-7细胞的抑制作用利用MTT法检测正丁醇层萃取物1g/ml、5g/ml、10g/ml、20g/ml、100g/ml、200g/ml的抑制率。正丁醇萃取物對MCF-7细胞的作用呈剂量依赖性，利用SPSS17.0计算得出IC50为81.30g/ml，结果如图1所示。3.3 TUNEL法检测正丁醇萃取物对MCF-7细胞凋亡的影响利用TUNEL法检测正丁醇萃取物对MCF-7细胞凋亡的影响，实验组细胞参加正丁醇层萃取物，终浓度为81.30g/ml，孵育48h。与对照组相比拟，实验组凋亡率增加
8、64.12%，结果如图2、3所示。4 讨论本研究利用MTT实验及TUNEL实验验证了葫芦巴种子醇提物正丁醇层萃取物对乳腺癌细胞MCF-7抑制及凋亡的影响。Mai等人研究证明葫芦巴种子油对Vero、WISH、MCF-7、HEp2四种细胞均有抑制作用，其中对MCF-7和HEp2两种细胞的作用最强6。Amr等人研究证明葫芦巴提取物对有DMBA诱导Wistar大鼠乳腺癌肿瘤有抑制作用7。我们首先利用MTT检测了葫芦巴种子醇提物各层萃取物作用48h对MCF-7细胞的抑制作用，高浓度的各层萃取物对MCF-7细胞均有抑制作用，其中正丁醇萃取物的抑制作用最强。然后我们又单独检测了正丁醇萃取物对MCF-7的作用
9、，结果显示正丁醇萃取物对MCF-7的作用呈现剂量依赖性。为进一步验证正丁醇萃取物对MCF-7细胞的抑制作用是由提取物诱导所引起的，我们又利用TUNEL实验检测了在正丁醇萃取物IC5081.30g/ml作用48h后的凋亡作用，结果显示，实验组凋亡率比对照组增加64.12%，验证了正丁醇萃取物能够诱导MCF-7细胞凋亡。Rahmati等人研究证明，从葫芦巴种子提取出的薯蓣皂苷元对肺癌细胞A549有抑制作用8。另有文献报道葫芦巴种子所含的番木瓜碱对淋巴样白血病有显著的活性，对小鼠肝癌HAc有明显的抑制作用9。葫芦巴提取物不同成分对癌细胞的作用不同，因此我们将进一步探索葫芦巴种子提取物对乳腺癌作用的具
10、体成分。综上所述，葫芦巴种子醇提物正丁醇萃取物诱导MCF-7细胞的凋亡。参考文献1 Naidu MM， Shyamala BN， Naik JP， et al.Chemical composition and antioxidant activity of the husk and endosperm of Fenugreek seedsJ.Food Sci Tech Int，202344：451-456.2 Kumar GS， Shetty AK， Sambaiah K， et al.Antidiabetic property of Fenugreek seed mucilage and s
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