1、乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究：研究乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽，为进一步研究花生粕专用蛋白基料产品提供理论根底。本研究运用单因素和正交试验方法对固态发酵制备花生蛋白肽工艺条件进行优化，其最正确制备工艺条件为：营养盐溶液添加量，乳酸菌液添加量，下发酵。此工艺下制备的花生蛋白肽的可溶性氮浓度到达，发酵液对，二苯基苦基苯肼自由基去除率为，羟自由基去除率为。花生蛋白肽的抗氧化活性结果显示，对超氧阴离子自由基的去除率是，对铁离子和铜离子螯合率分别为和，对脂质过氧化的抑制率为，铁复原力和钼复原力吸光值分别为和。关键词：乳酸菌；固态发酵；花生蛋白肽；抗氧化活性花生为豆科一年生草本植物，含有的
2、蛋白质和的碳水化合物。花生籽仁提取油脂后剩余的淡褐色或深褐色的小块状或粉末状的副产物称为花生粕，每年产量达，是一种大宗蛋白质和多糖资源。由于榨油过程中的热变性使得花生粕的营养价值下降，通常用做家畜饲料或肥料，产品附加值低，资源浪费严重。花生粕中的蛋白质经水解后可得到活性短肽，具有去除自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化等抗氧化作用，抑制血管紧张素转换酶活性以及抑制葡萄糖苷酶活性和降血糖作用。目前，蛋白质水解产生蛋白肽产品通常有三种方法：酸水解法、蛋白酶水解法和微生物发酵法。酸法水解蛋白，氨基酸受损严重，水解难控制而较少应用；酶解法可大量生产含有生物活性肽的粗酶解物，但用于水解反响的蛋白酶的种类
3、少，不能很好地降解蛋白，使制取的生物活性肽苦味不能根本脱除，从而影响产品口感；微生物发酵法液体发酵法和固体发酵法具有发酵周期短，降低生物活性肽的生产本钱等优点，具有广阔的发展前景。相比于液态发酵法，固态发酵法的优势非常明显。首先，用于固态发酵的菌种的种类更多、工艺过程更为简化；其次，固态发酵法可以实现更大规模生产，花生蛋白肽产量更大，制备花生蛋白肽的生产本钱明显降低；第三，固态发酵过程中根本无对环境造成污染的废物产生。微生物固态发酵过程中能分泌多种蛋白酶将大分子蛋白水解为蛋白肽，同时，蛋白酶还可以水解除去花生蛋白中的胰蛋白酶抑制剂等抑制因子和凝集素等抗营养因子。本研究利用乳酸菌为发酵菌种，采用
4、固态发酵技术，以发酵时间、发酵温度、菌液量和营养盐溶液量为试验因素，可溶性氮浓度、自由基去除率和羟自由基去除率为考察指标，通过单因素和正交试验对乳酸菌发酵条件进行优化，以期得到最优的发酵条件，同时研究了发酵产物的体外抗氧化活性。旨在为今后深入研究固态发酵花生粕蛋白产品在花生抗氧化活性蛋白肽、高营养生物饲料、食品酿造专用蛋白基料中的应用提供理论根底。材料与方法材料与试剂热榨花生粕：山东鲁花集团。乳酸菌 为本实验室别离保藏的菌种。，二苯基苦基苯肼、公司；液体培养基公司；尿素、无水葡萄糖均为分析纯试剂国药集团化学试剂有限公司。培养基固体培养基为液体培养基中添加琼脂粉；固态发酵培养基：热榨花生粕 粉碎
5、过目筛，灭菌。菌种生长曲线绘制方法从菌落平板上挑一个单菌落加到的液体培养基中，在、条件下培养，每隔在下测定吸光值。乳酸菌液体种子制备方法将的液体培养基参加三角瓶中，接入活化的菌种环，、条件下培养，当菌种生长到对数期，即菌种数约为个 时，即可用于固态发酵试验中。乳酸菌固态发酵花生粕工艺在固态发酵培养基中参加乳酸菌液体种子和营养盐溶液，在一定温度下密闭发酵一定时间，发酵结束后参加蒸馏水，离心，取上清液过滤并定容至，待分析。乳酸菌固态发酵花生粕单因素及正交试验设计选取四个关键因素：发酵时间、发酵温度期明强强，等：乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究、菌液量和营养盐溶液量来进行单因素及正交试验
6、，以发酵产物中的可溶性氮浓度、自由基去除率和羟自由基去除率为评价指标，确定最正确工艺参数。每组试验进行次平行试验，取平均值作为试验结果。单因素试验根本试验条件为：发酵时间，发酵温度，菌液量为，营养盐溶液量为。各因素其他试验水平见表。表单因素试验水平表单因素发酵时间 发酵温度 菌液量 营养盐溶液量 测定方法可溶性氮含量的测定采用法取样品液参加试剂将碳酸钠与氢氧化钠等体积配制碳酸钠氢氧化钠溶液，硫酸铜与酒石酸钾钠等体积配制硫酸铜酒石酸钾钠溶液，将这两种试剂按的比例配合，即为试剂，混合均匀，于室温放置。再参加的酚试剂，立刻混合均匀，水浴 保 温。以 试 剂 空 白 液 调 零，在处比色，根据标准曲线
7、回归方程计算发酵液中可溶性氮含量。抗氧化活性的测定自由基清除率、羟自由基去除率、超氧阴离子自由基去除率、铁复原力、钼复原力、铁和铜离子螯合力、抑制脂质体过氧化力都按照等方法测定。结果与分析菌种生长曲线的绘制乳酸菌的生长曲线见图，生长停滞期为，指数期为，稳定期为，衰亡期为以后。因此，在乳酸菌固态发酵研究中取处于指数期的菌龄的菌种用于发酵试验。单因素试验结果发酵时间对发酵效果的影响图所示，在发酵时间范围内，发酵液中可溶性氮含量先升高后下降，在出现最大值；自由基去除率呈现略微减小趋势；羟自由基去除率呈现先增加后减小趋势，但变化幅度不大。发酵初期，乳酸菌处于生长期，发酵液中菌体数量和所产蛋白酶含量都较
8、少，使得蛋白水解产物较少，那么可溶性氮含量少。随着发酵时间延长，发酵液中积累了相当多数量的蛋白酶，蛋白质底物与酶接触几率增加，水解产物增多，可溶性氮含量到达最大值。发酵时间继续增加，一方面发酵体系中营养物质已经消耗较多，乳酸菌生长繁殖与蛋白酶水解反响都需要底物蛋白质，不利于乳酸菌生长繁殖，另一方面乳酸菌生长到稳定期乃至衰亡期，菌 花生学报卷体数量和蛋白酶数量不再增加，导致可溶性氮含量减少。综合评价发酵时间对这三种指标的影响，确定作为正交试验发酵时间水平范围。发酵温度对发酵效果的影响如图所示，在发酵温度范围内，发酵液中的可溶性氮含量呈现先减小后增加趋势；自由基去除率逐渐减小，但变化不大；羟自由基
9、去除率先增加后减小。温度是影响乳酸菌生长的一个重要因素，在温度范围内，乳酸菌快速生长繁殖，虽然产生大量的蛋白酶，但是乳酸菌生长需要消耗蛋白质，与蛋白酶水解反响竞争底物蛋白，使得水解反响速率降低，发酵液中可溶性氮含量减少。在此温度范围内的发酵液中的蛋白肽的活性较高，那么去除自由基和羟自由基的效果较好。当温度继续升高时，乳酸菌的生长繁殖减缓，使得所产生的蛋白酶有充足的底物蛋白水解，发酵液中的可溶性氮含量增加。但是，发酵体系中蛋白酶含量增加使得已经水解生成的蛋白肽继续水解成更小分子的肽或游离氨基酸，致使对自由基去除率下降。综合评价发酵温度对这三种指标的影响，确定作为正交试验发酵温度水平范围。菌液量对
10、发酵效果的影响如图所示，菌液添加量在范围时，发酵液中可溶性氮含量先减小后增加再减小，在出现最大值；自由基去除率呈现减小、增大的趋势；羟自由基去除率呈现逐渐增加的趋势。当花生粕质量一定时，乳酸菌接种量，花生粕中的蛋期明强强，等：乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究白质既能满足乳酸菌生长繁殖又能提供足够的底物蛋白用于蛋白酶水解作用。当乳酸菌接种量在范围时，发酵体系中的乳酸菌增加，那么所产生的蛋白酶含量也增加，水解反响速率加快，发酵液中的可溶性氮含量逐渐增大直至到达最大值。当乳酸菌接种量继续增加时，发酵体系中的营养物质满足不了过多菌种的生长繁殖的需要，使得乳酸菌生长受到抑制，产生蛋白酶量减少，发酵液中的可溶性氮含量随之减少。综合评价菌液量对这三种指标的影响，确定作为正交表正交试验设计与极差分析结果序号可溶性氮浓度自由基去除率