1、天道酬勤保加利亚乳杆菌的发酵培养基优化杨阳 杨波摘 要：采用響应面法对保加利亚乳杆菌的培养基进行优化，Plackett-Burman PB设计对培养基中各因素影响的效应进行评价，结果说明：糖蜜、工业蛋白胨和CaCO3对生物量影响显著。关键词：保加利亚乳杆菌;培养基优化;响应面乳酸菌主要存在于畜、禽肠道以及奶制品、酒曲等食品中，其作为微生态制剂还广泛地应用于食品1、保健2，3和动物饲料等领域;乳酸菌具有抗菌、维持微生态平衡4、抑癌和增强免疫力5等重要功能，且能赋予食品特殊的风味，是极有价值和开发前景的菌种。因而，研制经济实惠、易收获菌体且活菌数高的增殖培养基是大多研究者共同关心的问题。在乳酸菌优
2、化培养基研究方面，刘云鹤等6通过正交及混料回归试验确定了高效经济的乳酸菌增殖培养基配方，可使发酵液中的乳杆菌和植物乳杆菌的活菌数分别到达 6.02109 cfu/mL、5.88109 cfu/mL。付荣霞等7通过正交实验研究了几种果蔬汁的添加量、培养时间、黄豆发芽时间对乳酸菌生长的影响，确定了最优的发酵工艺，在此条件下，乳酸菌的菌数为13.8107 cfu/mL，pH为3.97。本研究在MRS的根底上，对其培养基配方进行了优化，选出了对保加利亚乳杆菌适合规模化生产的发酵培养基，对后期高密度发酵及活性乳酸菌的制备有指导意义。1 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 材料保加利亚乳杆菌：购于中国
3、工业微生物菌种保藏中心CICC 23764。1.1.2 培养基菌种斜面培养基MRS培养基：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氢二铵2.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、七水硫酸镁0.58 g、一水硫酸锰0.25 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，固体培养基中参加2%的琼脂，pH 6.4。种子培养基、优化前的根底培养基：MRS培养基，250 mL 三角瓶，装量50 mL。1.2 方法1.2.1 生物量的测定细胞OD值的测定：取菌体发酵液5 mL参加10 mL的离心管中，5000 r/min离心10 min
4、，弃上清，沉淀菌体，再参加5 mL的蒸馏水反复摇匀洗涤，离心弃上清，重复洗涤至无色。稀释后的菌体在600 nm 波长处，用蒸馏水作空白进行测定，OD600nm=OD读数稀释倍数8。1.2.2 培养基优化通过单因子试验确定保加利亚乳杆菌培养基的最适碳、氮源，用Design Expert 8.0软件中2水平筛选出影响保加利亚乳杆菌生物量的显著因子，再通过爬坡试验和响应面分析对显著因子的水平进行优化9。2 结果与分析2.1 Plackett-Burman试验设计与分析考虑到实际生产中的原料本钱及来源，选定糖蜜、工业蛋白胨进行单因素优化预试验，确定其最正确浓度分别为150 mL/L和3%资料未显示。用
5、Design Expert按Plackett-Burman实验设计进行实验，将各个因素设计成高 +1 和低 -1 2个水平，高水平是低水平的1.25倍。Plackett-Burman实验设计每组的实验结果，根据此结果进行显著性分析，糖蜜、酵母粉、工业蛋白胨、磷酸氢二钾、一水硫酸锰和磷酸氢氨表现为正效应，七水硫酸镁和碳酸钙表现为负效应。糖蜜、工业蛋白胨、酵母粉、碳酸钙的P值分别为0.0248、0.0160、0.0277、0.0261，可信度均大于95%，表现为显著。工业蛋白胨的浓度对乳酸菌生物量影响最大，其次是糖蜜和碳酸钙。因此确定工业蛋白胨、糖蜜、碳酸钙为主要影响因素，进行下一步实验。2.2
6、响应面分析的试验设计及结果根据最陡爬坡实验确定了显著因素浓度的取值区间。利用Design Expert进行中心组合的实验设计，将最陡爬坡试验的3 个因素糖蜜、工业蛋白胨和碳酸钙分别标记为X1、X2、X3，以发酵10 h后的OD值作为响应值，记为Y，各变量水平见表4，实验结果见表5。根据表5的实验结果通过Design Expert进行显著性分析，建立多元二次回归方程：Y=6.53+0.033X1+0.12X2-0.034X3+0.016X1X2-0.16X1X3-0.034X2X3-0.11X12-0.12X22-0.14X32方程的方差分析结果，模型大于F值的概率P0.01，说明模型非常显著，
7、对响应值Y的影响非常显著，可信度较高;模型失拟项的P值为0.1251，不显著，决定系数R2=0.9162，说明因变量与考察的自变量之间的线性关系显著;综上所述，使用该模型可以较好的对响应值进行分析和预测。2.4 最正确浓度确实定及验证试验根据上述回归方程，以确认糖蜜、工业蛋白胨、碳酸钙3个因素对乳酸菌生物量的影响，3个因素两两相互作用的图像开口均是向下的，说明可以由拟合方程求出预测的生物量的最大值。由Design Expert软件分析得到最适培养基组成为糖蜜180 mL/L，工业蛋白胨3.52%，碳酸钙0.15%，酵母浸粉3%、磷酸氢二钾0.2%、七水硫酸镁0.15%、轻质碳酸钙0.1%、一水
8、硫酸锰0.002%、磷酸氢氨0.15%。预测在此组成条件下，乳酸菌生物量最大，OD600nm值为6.50。参考文献：1 杨洁彬. 乳酸菌M. 轻工业出版社， 1996.2 陈杰， 徐冲， 孙翠焕，等. 乳酸菌在食品工业中的应用现状及开展前景J. 微生物学杂志， 2023， 323：91-94.3 田永峰， 吴天祥， 胡晓瑜，等. 乳酸菌在酿造和食品工业上的应用J. 酿酒科技， 20224：90-93.4 赵龙飞. 乳酸菌的保健功能及其在食品中的应用研究J. 中国调味品， 2023， 346：30-33.5 张金桃， 周传云， 侯爱香. 乳酸菌的保健功能及其保健机理的研究C/ 益生元国际论坛.
9、2022.6 刘云鹤. 高效乳酸菌增殖培养基的筛选J. 淮海工学院学报.自然科学版， 2003， 124：59-62.7 付荣霞， 鲍雅楠， 崔艳，等. 几种果蔬汁对乳酸菌增殖的影响J. 贵州农业科学， 2023， 406：187-189.8 Romanos M A， Scorer C A， Clare J J. Foreign gene expression in yeast： a reviewJ. Yeast， 1992， 86： 423-488.9 Velly H， Fonseca F， Passot S， et al. Cell growth and resistance of Lactococcus lactis subsp. lactis TOMSC161 following freezing， drying and freeze-dried storage are differentially affected by fermentation conditionsJ. Journal of Applied Microbiology， 2023， 1173： 729-740.