1、NG-1 对 1 型 DM 大鼠背根神经节影响的机制李海涛1林劲1韩丽珍2王裕岱1滕丽峰1(海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)1 心血管内科，海南海口570311;2 病案室)摘要 目的探究神经调节蛋白(NG)-1 对 1 型糖尿病(DM)大鼠背根神经节影响的机制研究。方法选取 SD大鼠，制成 DM 模型采用链脲佐菌素(STZ)方法进行，确定诱导成功后进行大鼠脊髓背根神经元细胞提取，对相关蛋白进行定量检测，分析神经细胞轴突长度，分析 NG-1 对 DM 大鼠神经元生产的影响，采用 Western 印迹检测、实时荧光定量聚合酶链反应(T-qPC)方法对整合素(ITG)B1/局部黏着斑激酶(
2、FAK)/蛋白激酶 B(AKT)信号通路蛋白表达情况，分析 NG-1 干预效果。结果DM 组神经元细胞 ITGB1mNA 含量明显低于 NC 组(P0.05)，DM 组神经元细胞内 ITGB1、FAK、p-FAK 及 AKT表达均明显低于 NC 组(P0.05);NG-1 可使生长相关蛋白(GAP)-43、Tau 表达上调及促进轴实生长，且 20 ng/ml 浓度时效果最为明显，各组间差异有统计学意义(P0.05);DM+N 组、DM+N+si 组 ITGB1、FAK、p-FAK、AKT 及微管蛋白(Tubulin)-表达明显高于 DM 组，而 DM+si 组明显低于 DM 组(P0.05)。
3、结论对于 1 型 DM 大鼠背根神经节神经元轴突生长，NG-1干预可起到促进作用，猜测 NG-1 可能是通过调节 ITGB1/FAK/AKT 通路发挥作用。关键词 背根神经节;糖尿病;神经调节蛋白;轴突再生;整合素中图分类号 587.1 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0648-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.036基金项目:海南省高层次人才基金(2019C368)第一作者:李海涛(1981-)，男，副主任医师，博士，主要从事心电生理与起搏研究。糖尿病(DM)是目前临床高发的慢性疾病，随疾病发展可出现多种并发症，威胁
4、患者生命安全。其中糖尿病神经病变(DNP)属于 DM 常见并发症，患者主要症状表现为活动能力下降、下肢感觉障碍等，甚至部分患者因控制不佳需截肢1，2。DNP 早期症状一般为下肢刺痛感、麻刺感或手脚麻木等，因症状特异性差往往被忽视。研究指出，DNP 症状的发生与神经末梢病变有关，受疾病影响神经末梢轴突可塑性降低，导致神经再生困难3。DM 患者最显著表现为糖代谢失衡，而随机体糖代谢失衡，多种激素介质分泌失调，使远端神经纤维生长受限。神经调节蛋白(NG)-1 属于神经调节蛋白家族，其胞外结构域与表皮生长因子相似，但是其具有较为保守的胞内结构域(NG-1-ICD)。不过 NG-1 对 DM背根神经节的
5、作用未见相关报道。本研究以 1 型DM 大鼠为研究对象，探究 NG-1 对 DM 背根神经节的作用机制。1材料与方法1.1实验动物选取成年 SPF 级雄性健康大鼠，体重 180 210 g，平均体重(200.52.4)g，所有大鼠购自赛业生物科技有限公司。1.2实验试剂及仪器青链霉素混合液、链脲佐菌素(STZ)、谷氨酰胺购于青岛浩赛科技股份有限公司;NG-1、胰酶粉购于 ProSpec 公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购于北京百普赛斯生物科技有限公司;即用型正常山羊血清购于上海昊海生物科技有限公司;生长相关蛋白(GAP)-43 一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、整合素(ITG)B1 一抗、磷酸化黏着斑
6、激酶(p-FAK)一抗、Tau 一抗均购于 CST 公司;微管蛋白(Tubulin)-一抗购于 Proteintech 公司;局部黏着斑激酶(FAK)一抗、蛋白激酶 B(AKT)一抗、Tau 一抗均购于武汉阿斯本生物技术有限公司。细胞培养箱购于上海鼎科科学仪器有限公司;倒置相差显微镜、荧光显微镜购于上海万衡精密仪器有限公司;细胞计数板购于美国 Thermo 公司;多功能酶标仪、流式细胞仪购于贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司;定量 PC 仪购于德国 Eppendorf 公司;共聚焦显微镜购于上海聚仪检测科技有限公司。1.3造模进行 DM 大鼠诱导，采用 STZ 法进行，在标准条件下进行 1 w
7、的适应性饲养，在进行 DM诱导前需禁食12 h，诱导当天对所有大鼠进行称重，并进行标记，抽取尾静脉血，对其血糖浓度进行检测。进行柠檬酸钠缓冲液配制，将 STZ 按 65 mg/kg的剂量为大鼠进行腹腔注射。对照组大鼠柠檬酸缓冲液注射剂量根据其重量进行计算。体重及尾静脉血糖浓度检测时间为完成注射 72 h 后，当大鼠持续1 w 血糖浓度在 16.8 mmol/L 以上时，则确定本次DM 大鼠模型造模成功。1.4分离培养大鼠背根神经节神经元细胞处死846中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷DM 大鼠及对照组大鼠，断头后将脊柱取出，使用含双抗的平衡盐溶液(D-Hank)进行 3 次冲洗，
8、使近端的椎管口进一步暴露，棘突向上，横断剪开与椎管二分之一处，该操作过程中注意保护背根神经节，分离脊髓双侧背根神经节(DG)，在显微镜下进行解剖，并使用显微剪剪碎处理好的 DG 组织，加入含10%胎牛血清的 DMEM/F12 和 1trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，经过滤、离心处理，弃上清后进行重悬，计数细胞后将阿糖胞苷加入。1.5免疫荧光检测对组织细胞进行免疫荧光检测，步骤如下:爬片固定;细胞通透;封闭;一抗孵育;二抗孵育;细胞核染色;制片;拍照。1.6Western 印迹检测步骤如下:制备蛋白样品;测蛋白浓度;蛋白变性;配胶;电泳;转膜;封闭、抗体孵育;曝光。1.7实时荧光
9、定量聚合酶链反应(PC)步骤如下:提取样本细胞总 NA;NA 浓度与纯度分析;cDNA 合成;PC 引物设计与合成;PC。引物 ITGB1 上游:5-ATGCTATOCCAACTACACTG-GC-3，下游:5-CACCAAGGCAGGTCTGACAG-3;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游:5-CGCTAA-CATCAAATGGOGTG-3，下游 5-TTGCTGACAATCT-TGAGGGAG-3。1.8siNA 转染合成 siNA 并将合成的 siNA置于20冰箱中保存，期间注意避光。在 DMEM/F12 中对提取 DM 的 DHs 细胞进行 4 6 h 培养，将样本按照随机方法将
10、 DM 大鼠 DGs 细胞随机分为 4 组，第 1 组为空白对照组(DM 组)，第 2 组在培养基中加入浓度为 20 ng/ml 的 NG-1(DM+N 组)，第 3 组在第 2 组基础上加入 ITGB1-siNA(DM+N+si 组)，第 4 组在对照组基础上加入 ITGB1-siNA(DM+si 组)。每组分别设置 3 个复孔，取无菌的 EP管进行细胞转染，加入对应试剂，待 DGs 细胞完成贴壁后将双抗的 Neurobasal/B27 培养液加入进行72 h 孵育。1.9统计学分析采用 SPSS18.0 软件进行 t检验。2结果2.1鉴定 DG 神经元细胞外形呈梭形或多角形，胞体较小，无突
11、起，折光度差，边缘毛躁的细胞可能是成纤维细胞。经染色后，神经元细胞胞质为绿色，细胞核为蓝色，在将 B、C 图进行融合后，可明显观察到孤立蓝色着色点，猜测该类染色细胞可能为杂质细胞，对于染色细胞核占比进行计数，确定本次研究细胞纯度在 90%以上，见图 1。A:显微镜下神经元细胞;B:Tubulin-特异性染色的神经元细胞;C:染色后的神经元细胞核;D:B 和 C 两图融合后成像图 1神经元细胞染色(免疫荧光，200)2.2ITGB1、AKT、FAK 在 DM 大鼠 DGs 细胞中的表达NC 组为大鼠原代神经元细胞，DM 组为 DM大鼠神经元细胞。DM 组神经元细胞 ITGB1mNA含量明显低于
12、NC 组(P0.05)，DM 组神经元细胞内 ITGB1、FAK、p-FAK 及 AKT 表达均明显低于 NC组(P0.05)，见表 1、图 2。表 1ITGB1、AKT、FAK 在 DM 大鼠 DGs 细胞中的表达(xs，n=10)组别ITGB1mNAITGB1FAKp-FAKAKTNC 组0.990.031.030.191.210.310.620.041.120.08DM 组0.580.020.720.170.410.060.250.030.600.04t/P 值13.342/0.0514.367/0.0514.387/0.0513.678/0.0512.897/0.05946李海涛等NG
13、-1 对 1 型 DM 大鼠背根神经节影响的机制第 3 期图 2两组 ITGB、FAK、AKT 蛋白表达2.3不同 NG-1 浓度对神经元突触再生能力的影响NG-1 可 使 GAP-43 与 Tau 表 达 上 调，与0 ng/ml比，20 ng/ml 浓度时其上调效果最为明显，各组间差异有统计学意义(P0.05)，NG-1 可促进轴突生长，且 20 ng/ml 浓度时其促进作用作为明显，各组间轴突长度具有统计学意义(P0.05)，见表 2、图 3、图 4。表 2不同 NG-1 浓度对神经元突触再生能力的影响对比(xs，n=10)组别GAP-43Tau轴突长度(m)0 ng/ml 组0.060
14、.010.050.0173.6212.6110 ng/ml 组0.250.061)0.310.031)181.5211.611)20 ng/ml 组0.460.111)0.560.131)213.6111.421)50 ng/ml 组0.260.021)0.240.021)164.5123.141)100 ng/ml 组0.110.021)0.140.011)112.6114.231)与 0 ng/ml 组比较:1)P0.05图 3各组细胞 Tubulin-轴突长度免疫荧光染色(m，50)1 5:0 ng/ml NG-1 组、10 ng/ml NG-1 组、20 ng/ml NG-1组、50
15、ng/ml NG-1 组、100 ng/ml NG-1 组图 4各组 GAP-43 及 Tau 蛋白表达2.4在轴突再生过程中 ITGB1/FAK/AKT 通路作用分析DM+N 组、DM+N+si 组 ITGB1、FAK、p-FAK、AKT 及 Tubulin-表达明显高于 DM 组，而DM+si 组明显低于 DM 组(P0.05)，见图 5、表 3。图 5各组 ITGB1/FAK/AKT 通路相关蛋白表达表 3各组轴突再生过程中 ITGB1/FAK/AKT 通路作用对比(xs，n=10)组别ITGB1FAKp-FAKAKTTubulin-DM 组0.210.130.240.050.060.0
16、50.170.050.160.05DM+N 组0.360.051)0.510.111)0.240.151)0.380.121)0.420.111)DM+N+si 组0.240.031)0.380.021)0.180.051)0.280.081)0.230.051)DM+si 组0.080.021)0.090.041)0.060.020.070.011)0.120.07与 DM 组比较:1)P0.05056中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷3讨论DM 最常见的并发症包含 DPN，随疾病发展，严重影响患者的生存质量。对单纯 DM 及 DNP 患者进行神经活检，发现 DNP 患者神经纤维数量明显降低，认为神经纤维丢失是导致 DNP 发病的关键因素4。有研究指出，在对 DNP 患者神经结构进行观察时发现，该类患者存在神经周围血管基底膜增厚及神经内膜血管缺损情况，认为在 DM 患者中存在较为严重的轴突萎缩或节段性脱髓鞘情况5。TIG由 和 亚基组成，可对细胞表面配体或细胞外基质配体进行识别。在大鼠感觉神经中存在 ITG1广泛表达情况，可在结合细胞外基质后发挥生物效应。ITG 的众多