1、分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1综述病毒宏基因组在医学上的应用与未来展望梁志坤李可胜蒋析文摘要 新型新冠病毒的爆发，给人类安全健康带来了巨大的威胁。在过去的经验中，发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。在过去十几年中，随着高通量测序技术的迅速发展，病毒宏基因组的理论以及技术已被证明在公共卫生，临床病原学诊断等方面发挥着重要的作用。此前，人们对病毒的认识被限制于病毒感染人体进而引起疾病，但是近些年随着人类基因组和微生物组研究表明，病毒与人体之间存在更广泛
2、的相互作用，部分病毒对人体无害，甚至是有益的。本文主要针对近些年来对病毒宏基因组的兴起与发展，研究的策略以及在医学上的一些应用前景进行综述，并提出病毒宏基因组的一些未来展望。关键词 高通量测序；病毒宏基因组；医学应用Application and future prospect of viral metagenomics in medicineLIANG Zhikun，LI Kesheng，JIANG Xiwen（Research Center of Medical and Pharmaceutical Bioengineering，Minstry of Health，National and
3、 RegionalJoint Engineering Laboratory for Clinical Medical Molecular Diagnostics，Guangdong Province Nucleic AcidMolecular Diagnostics Engineering Technology Research Center，Guangdong Provincial Clinical Medical Molecular Diagnostics Engineering Technology Center，DAAN Gene Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdon
4、g，510665）ABSTRACT The outbreak of the 2019Novel Coronavirus（2019nCov）has posed a huge threat to human safety and health.In the past，the discovery and identification of new viruses and their relationship with disease have been the primary tasks in the prevention，diagnosis，and treatment of emerging vi
5、rulent infectious diseases.In the past decade，with the rapid development of highthroughput sequencing technology，the theory andtechnology of viral metagenomics have been proved to play an important role in public health，clinical etiologicaldiagnosis.Previously，peoples understanding of viruses was li
6、mited to viruses infecting the human body andcausing diseases.However，in recent years，as research on the human genome and microbiome has shown thatthere is a wider interaction between viruses and the human body，some viruses are harmless to the human body oreven beneficial.This article focuses on the
7、 rise and development of viral metagenomics in recent years，researchstrategies and some application prospects in medicine，and puts forward some prospects of viral metagenomics.KEY WORDS Highthroughput sequencing；Viral metagenomics；Medical applications感染性疾病仍是危害人类健康和全球公共卫生安全的重要问题，而感染性疾病有许多来源于病毒。根据以往的经
8、验来看，发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。传统意义上有很多用于发现新病毒的方法，如病毒分离、核酸检验、血清学试验等，但是这些方法有较大的局限性。21 世纪以来，随着测序技术快速发展，尤其是下一代测序基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFE0200400）；广东省重点领域研发计划项目（2022B1111020003）；广州市科技重点研发计划（202206080014）作者单位：卫生部医药生物工程技术研究中心，临床医学分子诊断国家地方联合工程实验室，广东省核酸分子诊断工程技术研究中心，广东省临床医学分子诊断工程技术中心，广州达安基因股份有
9、限公司，广东，广州，510665通信作者：蒋析文，Email： 177DOI:10.19930/ki.jmdt.2023.01.014分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1技术（Nextgeneration sequencing technology，NGS）的广泛应用和新兴学科宏基因组学（Metagenomics）的出现为探索未知病毒提供了技术支持和理论依据。此外，但是近些年随着人类基因组和微生物组深入研究表明，病毒与人体之间存在更广泛的相互作用，并且有希望应用在临床治疗上。本文主要就近些年来对病毒宏基因
10、组的兴起与发展，研究的策略以及在医学上的一些应用前景进行综述，并提出病毒宏基因组的一些未来展望。1病毒宏基因组的发展由来宏基因组学于 20 世纪 90 年首次由 Schmidt等1提出，最初是应用于海洋微生物的研究。直到2003 年，Breitbart M 才首次将病毒宏基因组应用于人粪便中病毒信息研究，结果发现了大量的新的基因型病毒，并揭示存在人体中的新病毒与人类疾病可能的关系2。病毒宏基因组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具有重要作用。截至 2018 年，已知来自 25 个病毒家族约 263种病毒
11、可以感染人类，但是，这只占到所有可能感染人类病毒的不到 0.1%，还存在大约 167 万种病毒尚未被发现，而在这167万种病毒中被估计大概有 63.1 万至 82.7 万种病毒有可能感染人类3，这说明对病毒的研究具有非常广阔的前景和现实意义。此后，一个国际研究团队，通过广泛地研究脊椎动物，包括鱼类、两栖动物和爬行动物，发现了超过 200 种以前不为人知的病毒，而且某些病毒能够导致包括流感和出血热等在内的疾病4，进一步证明了许多未知的病毒可能感染人类。2宏基因组的研究策略2.1靶向mNGS分析靶向 mNGS 指的是靶向富集样本中特定类型的微生物，通过增加序列数据中病原体读取的数量和比例来提高对目
12、标微生物的检测灵敏度的一项技术。目前，靶向富集主要有几种思路：设计特定的引物来靶向扩增：这种靶向扩增可以是特定区域，例如 16s/18s57；也可是横跨整个基因组的，例如完整病毒扩增89。设计捕获探针富集10，即通过捕获探针富集对文库进行杂交。这些技术被证明在研究环境中提高了宏基因组检测的灵敏度，特别是对于病毒。比如，Deng等11设计的带有靶向引物富集（MSSPE）的宏基因组测序，该方法相比于普通 mNGS 可富集目标 RNA 病毒序列含量约 10 倍，同时保留对其他病原体的宏基因组敏感性。Hayden 等12提出了一种计算方法（CATCH），可实现完整病毒基因组探针的设计，高效用于病毒检测
13、、序列捕获，有助于实现更敏感和更经济有效的宏基因组捕获测序。2.2非靶向mNGS分析非靶向 mNGS 放弃使用特异性引物或探针，针对环境样本中全部 DNA 和/或 RNA 进行测序。临床样本的非靶向 mNGS 可能是综合诊断感染最有希望的方法。原则上，几乎所有的病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，都可以在一次检测中识别。但是这种策略的一个局限性就是其灵敏度严重依赖于背景水平，这种情况尤其在组织样本中特别明显，因为不同于无细胞体液，组织的样本增加了人类宿主背景，导致微生物读长的数量和比例减少，从而降低了对 mNGS 的敏感性13。此外，从一些复杂的样本如呼吸道分泌物、粪便等中鉴定或者诊断与疾病
14、相关的微生物也比较困难14。目前，非靶向 mNGS 已经有不少在临床实验室成功诊断感染的案例，包括脑膜炎或脑炎、脓毒症和肺炎等15，这些案列可以对实际临床试验提供宝贵的参考价值。3病毒宏基因组在医学上的应用3.1在临床病原检出中的应用目前，临床上尚有一些病因不明的急性或慢性感染性疾病，给特异性诊疗带来了巨大困难。相对于传统的病原诊断方法，病毒宏基因组技术自发展以来，在临床病原的鉴定上发挥了极大的优势。目前，已经有大量的研究将病毒宏基因组学应用于临床并成功地进行病原体检测1621。比如近些年，有许多病毒展现出具有感染神经系统的潜力，临床多表现为脑炎，研究人员通过宏基因组技术成功地鉴定出了这些病毒
15、，其中包括埃博拉，寨卡，基孔肯雅，浓核，卡什谷，西尼罗和玻瓦桑病毒等1619，2223。宏基因组因其测序具有无偏倚性、高覆盖和高效性的特点，使得与其他检测技术如多重 PCR、检测芯片等相比，其在某些样本中病毒感染的诊断有更高的检出率，且能发现被遗漏未检出的病毒2021，说明了病毒宏基因组在临床上 178分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1病原的鉴定具有很大的优势。3.2在公共卫生领域的应用病毒宏基因组还在公共安全卫生方面发挥着重要作用。历史上，利用宏基因组测序技术研究人员已经成功鉴定多起由病毒引起的流行病
16、，比如由埃博拉病毒引起的乌干达出血热24，H1N1 型流感病毒引起的猪流感25、寨卡病毒感染疫情26和H7N9 流感病毒疫情27等。此外，通过追踪溯源发现许多病毒很可能来源于动物，表现出病毒向人类快速扩张的迹象。比如在2019年新冠爆发初期，Wu 等28利用宏基因组技术，从新冠肺炎病人的支气管肺泡灌洗液中检测出了病原体，并通过的与之前的SARS 病毒比较，最终确定了这是一种全新的冠状病毒 SARSCoV2，为全世界迅速展开冠疫防控、开发诊断试剂和疫苗提供不可或缺的基础。因此，加大病毒宏基因组在全球的广泛应用将有助于我们更加了解病原感染信息，提供预防措施信息和防控疫情。3.3在临床治疗上的应用以往大多数的病毒宏基因组研究都集中在有害病原的检测当中，但是人体中还存在着一种感染细菌的病毒噬菌体。噬菌体约 100 年前被发现，人们对噬菌体的研究极大的改变了生命科学的基础认知和相关研究29。近些年的研究表明噬菌体在人体健康中也可能发挥着重要的作用。例如，在某些疾病如炎症性肠炎以及多种类型糖尿病患者肠道内，其噬菌体的含量和种类都有明显的差异，揭示肠道噬菌体组和一些疾病可能产生关联3032。更令人兴