1、收稿日期 修回日期 作者单位 湖北省武汉市东西湖区人民医院 骨科，作者简介 林 浩（），男，硕士，主治医师文章编号（）基础医学 通过调节 抑制骨肉瘤发生发展的机制研究林 浩，徐德利，张 凯摘要目的：探讨长链非编码（）通过调控 抑制骨肉瘤发生发展的分子机制。方法：体外培养人骨肉瘤细胞系，分别将 过表达载体质粒或空载质粒转染至 细胞，实时荧光定量（）检测转染效率，采用细胞计数法（）和 实验分析 细胞增殖、侵袭和迁移能力，双荧光素酶报告基因实验和 检测 和 的靶向调控关系。同时过表达 和，并检测 细胞增殖、侵袭和迁移能力。结果：检测结果显示，与 组比较，组 在 细胞中的表达量明显升高（）。转染 和
2、后，组细胞增殖活力均低于 组和 组（）。检测结果显示，组与 组比较侵袭和迁移细胞数明显减少（）。与 之间存在特异性结合位点，与 组比较，转染 能够抑制 细胞的相对荧光素酶活性（），与 组和 组比较，组 细胞中 的表达量均降低（）。与 组和 组比较，组 细胞中 的表达明显升高，吸光度值明显升高，侵袭和迁移细胞数明显增多（）。结论：能够抑制骨肉瘤 细胞增殖、侵袭和迁移，其作用机制可能与靶向抑制 的表达有关。关键词 骨肉瘤；长链非编码；中图法分类号 文献标志码 ：，（，）：（）：，（），：（），（）（），（），（），（）：，；骨肉瘤（，）主要发生在青少年和儿童中，病情发展迅速，病死率高。目前，的主要
3、治疗方法包括手术、化疗、免疫疗法和基因疗法蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期等，尽管这些医疗技术对病人生存时间有所改善，但存活率仍然很低，病人预后较差。因此，阐明 的分子机制，有助于为 病人的治疗提供新的方法。长 链 非 编 码 （，）是一类长度大于 个核苷酸的非编码。近年来，越来越多的研究 发现，在肿瘤的发生和发展中起着极为重要的作用；许多 在 中差异表达，并且其表达的失调与 的发展有关，因为 可充当致癌因子或肿瘤抑制因子。是位于 染色体上的一种，在人类多种肿瘤发生和进展中发挥调节作用。潘海霞等研究显示，与非肿瘤组织比较，组织中 的表达降低，且与肿瘤分期、远处转移及肿瘤分化密切相关，提示 参
4、与调节 的发生发展，因此本实验探讨 对 细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其调控 发生和发展的作用机制。现作报道。材料与方法 细胞和主要试剂 人 细胞株（中国科学院上海典型培养物保藏委员会细胞库）；培养基和胎牛血清（美国 公司）；青霉素和链霉素（北京雷根生物技术有限公司）；试剂和脂质体 转染试剂（美国 公司）；逆转录试剂盒和 检测试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（；）；试剂（日本同仁化学研究所）；小室和 基质胶（美国 公司）；过表达载体质粒及空载质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；及 （广州市锐博生物科技有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（上海翊圣生物科技
5、有限公司）；和 报告基因载体（美国 公司）。实验分组人 细胞株 培养在含胎牛血清的 培养液基中，放置在常规细胞培养箱中，条件设为 、饱和湿度；每隔 换液 次，待 细胞生长融合度至 以上时，使用 胰蛋白酶消化传代。取对数期的 细胞，将 细胞以 个 孔接种到 孔板中，置于 培养箱培养至细胞融合度达时，使用脂质体 转染试剂进行转染，具体操作步骤按照转染试剂说明书，将转染 过表达载体质粒的 细胞记为 组，转染空载体质粒的 细胞记为 组，将未行转染的 细胞记为 组；将共转染 过表达载体质粒和 的 细胞记为 组，共转染 过表达载体质粒和 的 细胞记为 组。实验 收集转染 的各组 细胞，采用 法提取细胞中总
6、，使用 测定 的含量，以 为模板，使用逆转录试剂盒将 合成第一链，根据 检测试剂盒说明书配置反应体系和扩增，以 为内参，分析 的相对表达量，以 为内参，分析 的相对表达量。采用相对定量 法进行计算，实验重复 次取均值。实验取对数生长期 细胞以 个 孔铺板于 孔板中，以 分组和转染，分别检测、和 时细胞增殖能力。在各个时间点向 孔板每孔细胞中加入 试剂，放置在 培养箱孵育 ，使用酶标仪于 波长测定吸光度值，实验重复 次取均值。实验 收集转染后的各组 细胞，用不含胎牛血清的培养液制备浓度为 单细胞悬液，取 细胞悬液加 入 小室的上室（包被为细胞侵袭实验，未包被为细胞迁移实验）中，在下室中加入 含
7、胎牛血清的 培养液，将细胞放置在常规培养箱中继续培养，取出小室，用湿润的棉签擦去上室细胞，以 多聚甲醛固定，结晶紫染色，以 洗去染液，晾干后在倒置显微镜下观察并拍照，计数各组穿膜细胞数，实验重复 次取均值。双荧光素酶报告基因实验对数生长期的 细胞种植到 孔板中，常规培养至细胞融合至，采用 将 与构建的 ，共转染至 细胞，继续培养 ，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组 细胞的相对荧光素酶活性，实验重复 次取均值。统计学方法 采用 检验、单因素方差分析及秩和检验。结果 各组 细胞中 表达量比较 检 测 结 果 显 示，与 组 比 较，组 在 细胞中的表达量明显升高（），而 组与 组差异无统计
8、学意义（）（见表）。表 在各组 细胞中表达量比较（）分组 组 组 组 组内 检验：与 组比较 各组 细胞增殖能力比较 检测结果显示，转染 后 组 细胞增殖活力差异无统计学意义（）；转染 和 后，组细胞增殖活力均低于 组和 组（），组与 组 细胞增殖活力差异无统计学意义（）（见表）。表 转染、和 后各组 细胞增殖活力比较（）分组吸光度值（）组 组 组 组内 检验：与 组；与 组比较 各组 细胞侵袭和迁移能力比较 检测结果显示，组与 组比较侵袭和迁移细胞数明显减少（），组与 组比较侵袭和迁移细胞数无明显变化（）（见表）。和 靶向关系验证生物信息学在线数据库 预测结果显示（见图），与 之间存在特异性
9、结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显 示，与 组 比 较，转 染 能够抑制 细胞的相对荧光素酶活性（），而 组 细胞的相对荧光素酶活性差异无统计学意义（）（见 表）。检测结果显示，与 组和 组 比 较，组 细 胞 中 的表达量均降低（），组和 组 细胞中 的表达量差异无统计学意义（）（见表）。表 各组侵袭和迁移细胞数比较（）分组侵袭细胞数迁移细胞数 组 组 组 组内 检验：与 组比较 表 各组细胞的相对荧光素酶活性比较（）分组 组 组 表 各组 细胞中 表达量比较（）分组 组 组 组 组内 检验：与 组比较；与 组比较 过表达 逆转过表达 对 细胞增殖、侵袭和迁移的抑制与 蚌埠医学院学报 年
10、 月第 卷第 期 组和 组比较，组 细胞中 的表达明显升高，吸光度值明显升高，侵袭和迁移细胞数明显增多（），组和 以上指标差异无统计学意义（）（见表）。表 各组 细胞中 的表达、吸光度值、侵袭和迁移细胞数比较（）分组吸光度值侵袭细胞数迁移细胞数 组 组 组 组内 检验：与 组比较 ；与 组比较 讨论 近年来，被鉴定为肿瘤发生和进展的新型调节剂。多种 表达失调与 的发生和发展密切相关。在体外和体内，这些 扮演致癌或抑癌因子的角色，在 的恶性生物学行为中起重要作用，因此，研究 在 中的特定作用及机制可能为 的治疗提供思路。在不同类型的癌症中起着不同的作用。如 的过表达抑制非小细胞肺癌细胞中癌细胞的
11、增殖和迁移。而 被证实是小细胞肺癌中的致癌，在体外能促进癌细胞的化学抗性、增殖和转移以及体内肿瘤的化学抗性和生长。此外，的高表达与黑素瘤病人的不良临床特征和总体生存时间短有关。在宫颈癌中，表达的下调与存活率低有关。等的研究显示，通过抑制 表达来增强三阴性乳腺癌的进展。但是，对 在 中的作用及分子机制知之甚少。本实验发现过表达 能够在体外抑制 细胞增殖、迁移和侵袭，表 明 在 中发挥抑癌作用。机制分析发现，对 细胞恶性生物学行为的抑制作用可能与下调 表达有关。基于以上研究推测，在癌症中是发挥抑癌还是促癌作用可能与癌症的不同类型以及其下游靶基因的不同有关。可作为 海绵调控细胞生长和转移。在宫颈癌中
12、 充当 的分子海绵，并反向调节宫颈癌细胞中的 水平，抑制 细胞增殖和侵袭。在本实验中，生物信息学分析表明 序列含有 的结合位点。双荧光素酶报告基因实验验证了这一预测。发现过表达 可降低 细胞中 的表达，提示 能够通过使 海绵化参与 的发生和发展。已被报道在 中表达上调，并与 病人的不良临床特征和预后密切相关，体外实验表明，可以增强 细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化。在本研究中，过表达 能够下调 的表达；挽救实验证实，在 细胞中，过表达 能够减弱 过表达对 细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。提示，过表达可能通过下调 来抑制 细胞的恶性生物学行为。综上所述，能够抑制 细胞增殖、迁移和侵袭，促进 的进程
13、，其作用机制可能与抑制 的表达有关。本实验结果表明 信号轴有望成为 早期诊断、治疗及预后评估的标志物，可能为 的治疗提供新的思路。参考文献 康治理，刘晓伟，武振方，等 基于生物信息学分析的骨肉瘤关键生物标记物的筛选 蚌埠医学院学报，（）：，（）：杨楠，陈天翔，刘润坤，等 长链非编码 在肝细胞癌中表达上调并促进肝癌细胞迁移和侵袭 蚌埠医学院学报，（）：杨硕，陈天天，王文锐，等 长链非编码 在紫 ，杉醇耐药乳腺癌细胞中的作用 蚌埠医学院学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：潘海霞，杨兰，胡洪林，等 在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义 中国肿瘤生物治疗杂志，（）：，：，（）：，（
14、）：，（）（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（本文编辑 刘梦楠）（上接第 页）徐芳，刘红梅，黄莺 银杏叶提取物对特发性肺间质纤维化成纤维细胞表型转化过程中 信号通路的影响 中国中西医结合急救杂志，（）：潘秀娟，刘家洪 银杏叶联合齐拉西酮治疗慢性精神分裂症的有效性及安全性研究 辽宁中医杂志，（）：李新纯，李庆，王超英，等 银杏叶胶囊联合阿立哌唑对精神分裂症患者认知功能的影响 中医杂志，（）：房茂胜，钱红，曾宽，等 对精神分裂症模型大鼠认知功能的影响 中华行为医学与脑科学杂志，（）：张潇剑，张姣，韩怀钦，等 精神分裂症小鼠行为学改变及海马齿状回颗粒细胞层 能神经元的表达 神经解剖学杂志，（）：欧阳俊摇，邹海艳，于萍，等 银杏叶提取物对慢性脑缺血模型大鼠脑组织突触后致密物 蛋白及递质氨基酸的影响 国际中医中药杂志，（）：张昊，印海翔，徐颺，等 诱导精神分裂症小鼠的 及 氧化酶通路机制研究 现代生物医学进展，（）：王巍，张昊，徐颺，等 帕潘立酮治疗 诱导精神分裂症小鼠的效果分析及 信号通路蛋白的参与作用 中南药学，（）：蔡菡，程万良，徐磊 建立精神分裂症动物模型研究进展 精神医学杂志，（）：（本文编辑 周洋）蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期